海洋交替假單胞菌活性物質的研究

丁立建，何 山，嚴小軍

寧波大學應用海洋生物技術教育部重點實驗室，寧波315211

海洋微生物是生物活性物質的重要來源［1-4］，交替假單胞菌屬(Pseudoalteromonas )是1995 年由Gauthier 等［5］人由Alteromonas 分離出來并建立的一個新的海洋細菌屬。近二十年來，在世界范圍海洋中，分離到多株交替假單胞菌。它在海洋中的分布非常廣泛，分布全球各地，可以生活在海底泥里，也可以共附生一些海洋動植物，研究發現交替假單胞菌屬具有保護其宿主比如無脊椎幼蟲、海藻和原生動物等抵抗外界不良環境［6］。由于它特殊的生活環境，因此具有特殊的代謝途徑，產生許多結構新穎、作用特殊的生物活性物質。據報道它能產生抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗污和抑藻等各種生物活性物質［7-26］。目前國外對該屬細菌已經開展探索性研究，并分離出了多株具有活性的海洋假交替單胞菌［9，12，14，16，17］。中國海洋資源十分豐富，海洋環境復雜，但國內對海洋交替假單胞菌研究較少，因此，開展針對海洋交替假單胞菌的研究具有很大的潛力。

1 海洋交替假單胞菌屬的生物學特性

海洋交替假單胞菌屬(Pseudoalteromonas )是一類輕度嗜鹽革蘭氏陰性、無芽孢、生鞭毛、需氧的海洋細菌，G+C 含量在37～50 mol%，生長需要海水，生長溫度在20 ℃左右，氧化酶陽性，主要以葡萄糖作為碳源，能夠生存于貧營養的海洋環境中［5，27］。與大多數可培養的菌屬不同，交替假單胞菌屬只能在海洋環境里分離得到，如卡內奧赫灣海恬蝓、海綿、海洋無脊椎動物表面、日本海藻共附生的細菌里、南極洋等中分離了海洋交替假單胞菌屬，這些發現表明海洋交替假單胞菌在海洋環境的分布是很廣泛的。

2 海洋交替假單胞菌屬產生的生物活性物質

據報道海洋交替假單胞菌能夠產生多種生物活性物質，包括抗菌、抗線蟲、抑藻、抗氧化、抗腫瘤等活性物質。

2.1 抗菌

Domonkos 等［7］從卡內奧赫灣海恬蝓中分離了海洋交替假單胞菌Pseudoalteromonas sp. (CMMED 290)，其代謝提取物顯示了對耐青霉素金黃色葡萄球菌具有顯著的抗菌活性。其中提取的親脂性產物中鑒定了兩個新的高度溴化的化合物，pentabromopseudilin 和bromophene。Isnansetyo 和Kamei 等［19］從海洋細菌Pseudoalteromonas phenolica sp. nov. 中得到1 個新的抗生素MC21-A，該化合物對耐青霉素金黃色葡萄球菌有殺菌作用，其作用效果與萬古霉素相當，但是作用機制與萬古霉素不同，MC21-A 主要是通過透化(permeabilization)細菌細胞膜來發揮作用的。Alim 等［12］通過發酵海洋細菌Pseudoalteromonas phenolica O-BC30T，并利用硅膠柱色譜、高效液相色譜分離純化得到MC21-B 化合物，通過紫外光譜、紅外光譜、質譜和核磁共振波譜分析鑒定結構。此外，通過體外實驗，發現它對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有抗性，最小抑制濃度達1 μg/mL。而且還發現對枯草芽孢桿菌抗菌活性很強，最小抑制濃度達4 μg/mL，但對革蘭氏陰性細菌和真菌沒抗性。2008 年，Wimolpun 等［14］在日本海藻Diginea sp.共附生的細菌里分離了一種交替假單胞菌屬，從該海洋細菌培養液提取出能抑制其他海洋細菌生長的代謝物。從這個細菌里分離了兩種新的四肽化合物，分別是環-(苯丙，脯，亮，脯)四肽和環-(異亮，脯，亮，丙)四肽，發現對芽孢桿菌和弧菌有生長抑制作用。

2.2 抗腫瘤

Zheng 等［28］從海綿Hymeniacidon perleve 中分離出海洋交替假單胞菌NJ6-3-1，其發酵物經色譜分析、結構鑒定，得到1 個β-咔啉生物堿Norharman。Norharman 在體外對人宮頸癌細胞HeLa 和胃癌細胞BGC-823 具有顯著的細胞毒活性，IC50為5 μg/mL。Domonks 等［13］從夏威夷島海綿里分離出一株海洋細菌，通過16s rDNA 分子鑒定為交替假單胞菌(Pseudoalteromonas rubra )，為了從該細菌里發現新的海洋藥物先導化合物，Pseudoalteromonas rubra 發酵提取親脂性的代謝物，發現對人類的腫瘤細胞有細胞毒活性，通過現代色譜和波譜技術發現活性成分是一種靈菌紅素，并命名為HBPG，該化合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌和白色念球菌有很好的抑菌效果。

2.3 抗線蟲

Francesco 等［9］從海洋無脊椎動物表面分離出海洋細菌Pseudoalteromonas tunicata D2，通過提取該細菌的代謝產物，鑒定出一個化合物tambjamine YP1，此化合物具有抗菌、抗腫瘤、免疫抑制劑、抗擴散等作用，而且在本研究中首次發現該化合物具有抗線蟲的作用。這也恰恰說明了無脊椎動物產生抗線蟲的作用是由宿主細菌產生的。

2.4 色素

Ashley Franks 等［16］首次從海洋細菌Pseudoalteromonas tunicata 分離到一種新的黃色色素化合物并通過核磁共振一維和二維圖譜以及高分辨率質譜鑒定為tambjamine 生物堿類化合物。這是人們在海洋細菌里的首次發現，可以為人們在海洋里找到新的色素提供一定的基礎。

2.5 抗氧化

Maya 等［17］從寒冷的南極洋里發現海洋細菌Pseudoalteromonas haloplanktis TAC12 能產生胞外8種環二肽和2 種多肽。通過制備型液相色譜和和核磁共振分離鑒定其結構。其中一種環二肽是首次發現這類結構，命名為環-(哌可啉，異亮氨酸)二肽。另外一種多肽通過DPPH 抗氧化研究，其抗氧化活性達75%(10 mmol)，命名為酪氨酸-纈氨酸-脯氨酸-亮氨酸肽。

2.6 抑藻

Taizo Sakata 等［15］在日本鹿兒島海灣海水里分離到一株海洋交替假單胞Pseudoalteromonas sp.A1-J11，它能產生三種羥基喹啉類化合物，對弧菌有一定的抗性。通過紙碟法研究其抑藻活性，發現其中一種分離的化合物AVS-03d 對硅藻的生長有很強的抑制。

2.7 其他

Kaneo 等［29］從帕勞群島海域上的海綿中分離了一株海洋細菌，通過16SrDNA 測定序列鑒定為Pseudoalteromonas sp.KP20，對其進行40 L 體積的發酵，發酵液過大孔樹脂富集，用甲醇洗脫，對餾分進行各種柱層析和HPLC 制備得到一個化合物，運用質譜和核磁共振技術對其結構進行鑒定，最終發現此化合物為鐵載體，這是首次在海洋交替假單胞菌里發現。

3 展望

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目前海洋微生物中研究的較多的是放線菌和藍細菌等門類，海洋交替假單胞菌作為一種新屬能夠產生多種不同的活性物質，當前還處于初級研究階段，因此被認為是21 世紀發現新型海洋藥物先導化合物的重要來源。近年來基因組學、生物信息學、分子生物學均取得突破性進展，我們認為，如何在傳統天然藥物化學的基礎上結合這些先進的技術，對海洋交替假單胞菌開展研究，是未來具有前景的研究領域:(1)哈佛大學christtopher T. Walsh 教授于2010 年提出“天然產物2.0”的概念，即從基因的角度發現天然產物［30］，主要是通過基因工程的技術發現、組合、合成一些隱性基因的天然產物［31-34］。比如Leah C.Blasiak 等［35］通過異源表達的方法，對海洋交替假單胞菌中的一些隱性天然產物基因進行幾個模塊的表達，通過液相色譜分離技術發現了2 個從未發現過的新物質，這對海洋假交替單胞菌天然產物活性物質的研究提供了一種新思維、新途徑。(2)近年了相繼出現了組學技術比如基因組學、轉錄組學、蛋白組學、代謝組學等，他們對海洋細菌的天然產物的研究提供了強有力技術支持。特別是代謝組學技術，通過代謝組學篩選天然產物和研究其生物合成的途徑以及代謝調控機制，以期找到更多的新穎的化合物［36-39］，為尋找具有藥物活性的先導化合物提供更廣闊的空間。

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