沉默c-maf基因對多發性骨髓瘤細胞系RPMI8226增殖和侵襲力的影響

徐 冬 呂曉偉 畢作木 任國華 王魯群

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）約占血液系統疾病的10%，是起源于B淋巴細胞的惡性腫瘤。新型的靶向治療藥物，如蛋白酶體抑制劑硼替佐米在提高緩解率、改善生活質量及延長患者壽命方面均優于傳統治療［1-3］。但是仍有相當部分患者療效較差，有待于我們發現新的治療靶點。Hurt等［4］發現，約50%骨髓瘤患者樣本中c-maf存在高表達。生理情況下，c-maf蛋白在漿細胞的細胞粘附、移動，細胞周期調控等生理過程中發揮作用。本研究利用RNAi技術沉默多發性骨髓瘤細胞系RPMI8226的c-maf基因，觀察其對多發性骨髓瘤細胞系RPMI8226的增殖和侵襲力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人多發性骨髓瘤RPMI8226細胞株：濰坊醫學院馮永堂教授惠贈。Matrigel膠：BD公司產品，Tran-swell小室：Coster公司產品，c-maf干擾序列及對照序列：Qiagen公司產品，小鼠抗人 survivin、MMP-2、MMP-9、β-actin、ARK5、cyclin B1單克隆抗體均購自美國Santa cruz公司，HPR標記山羊抗小鼠IgG購自北京鼎國生物公司，細胞總蛋白提取試劑盒：北京康成生物公司產品，Caspase-3/7活性檢測試劑盒：美國Promega公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞復蘇與培養 37℃水浴箱中復蘇細胞，成功后置于CO2培養箱培養傳代。

1.2.2 脂質體法轉染多發性骨髓瘤細胞系 實驗分組：實驗組（c-maf siRNA組）；陰性對照組（NC siRNA組）；空白對照組（mock siRNA組）。24孔培養板中將siRNA、脂質體混合液100 μL按照不同的試驗分組進行轉染，鏡下觀察轉染效果。

1.2.3 RT-PCR檢測c-maf基因的表達 逆轉錄、擴增目的基因。PCR反應條件：94℃變性45s，56℃退火50s，72℃延伸1 min，共25個循環。表達抑制率計算公式：表達抑制率（%）=（1-c-maf條帶平均灰度值/β-actin條帶平均灰度值）×100%。引物序列：c-maf：P1 5'-AGCG GCTTCCGAGAAAAC-3'，P2 5'-ACTTGCGAGTGGGCTC AG-3'；β-actin：P1 5'-GACTGCCTGCCTCACTTT-3'，P2 5'-GCTGATCTCGGCTCTGT-3'。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖抑制效應 分別取培養1～7d各組細胞行MTT實驗。以時間為橫坐標，各組OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.5 Transwell小室侵襲試驗 Matrigel膠包被Transwell小室上室面。取轉染后24 h的各組細胞1×105個移到無血清培養基中，放入Transwell小室上層。下室加入含15%胎牛血清的培養基，置5%CO2培養箱24 h。取出Transwell小室，倒置顯微鏡下計數下室面10個高倍視野細胞數，取平均值。

1.2.6 細胞周期檢測 收集轉染后0、24、48、72 h各組細胞，乙醇固定過夜，RNA酶水浴消化后加入碘化丙啶（PI，50 μg/mL），4℃放置15 min后流式細胞儀檢測。

1.2.7 Western blot檢測 survivin、MMp-2、MMP-9、ARK5、cyclin B1蛋白表達PBS漂洗、裂解細胞，蛋白質定量、分離后PVDF膜上免疫雜交，洗滌后將濾膜與標記的抗免疫球蛋白抗體溫育。發光法確定靶蛋白數值。

1.2.8 Caspase活性檢測 取培養1、2、3 d的各組細胞，按照試劑盒的操作說明將緩沖液與底物混合，混合物100 μL加入等體積培養的細胞懸液后孵育3 h，酶標儀檢測并計算Caspase活性。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 倒置熒光顯微鏡下觀察轉染后的細胞

在熒光顯微鏡下觀察實驗細胞，絕大多數細胞都熒光著色，與背景反差明顯，熒光著色細胞有明顯的細胞輪廓（圖1）。

圖1 轉染24 h后倒置熒光顯微鏡下觀察轉染后實驗細胞（×100）Figure 1 MM cells under the fluoroscope at 24 h after transfectedion（×100）

2.2 RT-PCR檢測c-maf基因的表達

實驗組條帶亮度較陰性對照組和空白對照組明顯弱（圖2）。表達抑制率：c-maf siRNA組：76.38%±7.36%，NC siRNA組：44.01%±6.31%，mock siRNA組38.66%±6.95%，差異有顯著統計學意義（P＜0.05，表1）。

圖2 c-maf siRNA對多發性骨髓瘤細胞系RPMI8226 c-maf基因表達的影響Figure 2 Effect of siRNA on c-maf mRNA expression in RPMI8226 cells

表1 c-maf siRNA抑制c-maf基因的表達Table 1 siRNA inhibits c-maf mRNA expression in RPMI8226 cells

2.3 MTT法檢測各組細胞的增殖活性

轉染c-maf siRNA后第1、2d，各實驗組增殖活性無明顯差異，48 h的OD值，c-maf siRNA組：0.65±0.07，NC siRNA 組：0.66±0.11，空白對照組：0.65±0.17，無統計學差異（P＞0.05），c-maf siRNA組較其他兩組在第3～7d出現差異，第5d差異最明顯，此時c-maf siRNA組OD值：0.67±0.08，NC siRNA組OD值：0.74±0.12，空白對照組OD值：0.75±0.29，比較有統計學差異（P＜0.05）。以時間為橫軸、OD值為縱軸繪制生長曲線（圖3）。7d后由于培養基營養成分消耗，失去統計意義。

2.4 沉默c-maf基因對人多發性骨髓瘤細胞系RPMI8226體外侵襲力的影響

增殖抑制實驗表明，c-maf基因沉默后第3d開始出現顯著差異。因此，為了減少細胞增殖對侵襲力實驗的影響，檢測侵襲力的實驗選定在轉染后24～48 h進行。結果顯示c-maf siRNA組、NC siRNA組、空白對照組粘附于下室面的細胞數量分別為：35.66±5.09、57.01±10.22、60.33±9.63。c-maf siRNA組與其余二組對比，差異有統計學意義（P＜0.05，圖4）。

2.5 流式細胞術檢測細胞周期變化

c-maf siRNA組在轉染后3天G2/M期比例逐漸增加，由16.20%升至51.10%，細胞周期阻滯在G2/M期。c-maf siRNA組的細胞周期圖出現亞二倍體凋亡峰（圖5，表2）。

2.6 Western blot檢測蛋白表達

Western blot檢測轉染72 h后，c-maf siRNA組、NC siRNA組、空白對照組的不同蛋白表達水平，結果示c-maf siRNA組 Survivin、MMP-2、MMP-9、ARK5、cyclin B1均明顯低于其他兩組（P＜0.05，圖6）。

2.7 Caspase-3/7蛋白活性檢測

轉染后，隨著時間延長c-maf siRNA組細胞的Caspase-3/7的活性逐漸增高，轉染0、24、48、72 h，各實驗組 Caspase-3/7活性為：c-maf siRNA：0.314±0.029、0.468±0.039、0.636±0.052、0.786±0.081，NC siRNA：0.314±0.029、0.350±0.035、0.361±0.033、0.373±0.038，Mock siRNA：0.314±0.029、0.348±0.026、0.357±0.033、0.370±0.034。c-maf siRNA組和其他二組比較差異有統計學意義（P＜0.05，圖7）。

圖3 轉染c-maf siRNA對人多發性骨髓瘤細胞系RPMI8226增殖的影響Figure 3 The growth curve according to the MTT assay in different groups of RPMI8226 after transfection with c-maf siRNA

圖4 c-maf基因沉默對人多發性骨髓瘤細胞系RPMI8226體外侵襲力的影響（*P＜0.05）Figure 4 The effect of c-maf siRNA on in vitro invasion activity of RPMI8226 cells

圖5 c-maf基因沉默對人多發性骨髓瘤細胞系RPMI8226細胞周期的影響Figure 5 The effect of c-maf siRNA on cell cycle progression of RPMI8226

表2 轉染后不同時間G2/M期細胞數量比例 （%）Table 2 The percentage of RPMI8226 cells in G2/M phase at different time points（%）

圖6 轉染后RPMI8226細胞的survivin、MMP-2、MMP-9、ARK5、cyclin B1蛋白表達的差異Figure 6 The expression of survivin,MMP-2,MMP-9,ARK5,and cyclin B1 protein in RPMI8226 cells after transfection

圖7 轉染后RPMI8226細胞的Caspase-3/7蛋白活性的差異Figure 7 The change of Caspase-3/7 protein activity in RPMI8226 cells after transfection

3 討論

如前所述，c-maf基因在50%骨髓瘤患者標本中異常高表達。研究顯示［5-7］，轉染外源性c-maf基因的小鼠B細胞可發展為MM。在高表達c-maf的MM細胞中，c-maf蛋白分子可促進新血管的生成；增加MM細胞的遷移力；提高對周期特異性化療藥的耐受性等。臨床資料顯示［8］，c-maf基因高表達者的腫瘤負荷較高，對傳統化療的有效率較差，導致總體生存和無進展生存較短。所以，c-maf基因高表達是MM患者的預后不良因素。

在細胞周期檢測中，沉默c-maf基因后細胞發生了G2/M期阻滯，提示c-maf蛋白是通過促進細胞周期誘導細胞增殖。細胞周期蛋白研究較多的是Cyclin D。但Park等［9］證實在多發性骨髓瘤細胞中有cyclin B的高表達。Tamura等［10］進一步研究證實，cyclin B1表達水平較高的MM患者，有較快的細胞增殖速率，在相同的化療周期間隔下，容易復發，所以對cyclin B1高表達患者建議縮短化療間隔。本實驗證實抑制c-maf基因的表達能下調cyclin B1，使細胞周期阻滯，所以靶向c-maf的藥物能減緩MM細胞的增殖速率，減少化療次數，降低復發率。凋亡峰的出現說明c-maf也抑制了RPMI8226細胞的凋亡。細胞凋亡的共同途徑是Caspase的激活，Caspase酶是凋亡過程的主要調控蛋白，Caspase-3是多種凋亡途徑共同作用的因子，其表達水平的高低決定著細胞凋亡程度［11］。Survivin是公認的凋亡抑制基因。本實驗發現，轉染c-maf siRNA的RPMI8226細胞Survivin蛋白表達水平降低，而Caspase-3/7活性增高，提示沉默c-maf基因誘導RPMI8226細胞凋亡與上調Caspase-3/7和下調Survivin基因表達有關。ARK5（AMPL-related protein kinase 5）是AMPK（AMP-activated protein kinase）的亞家族成員之一，ARK5在各種腫瘤細胞系中表達。有研究［12，13］證實把 ARK5基因轉染到乳腺癌細胞MDA-MB-231，增強了其侵襲和轉移的能力，而沉默內源性ARK5基因則細胞侵襲轉移能力降低，并且細胞侵襲力和MMP-2、MMP-9蛋白的表達呈正相關。Chen等［14］在人非小細胞肺癌細胞中也得到了相似的結果。Morito等［15］發現在ARK5基因啟動子區有兩個MARE序列，使c-maf蛋白分子能與之結合，上調ARK5基因的表達。所以，ARK5是c-maf的下游靶基因。本研究發現，在沉默c-maf基因后ARK5、MMP-2、MMP-9的蛋白表達均明顯降低，提示在RPMI8226細胞中c-maf基因很可能是通過上調ARK5基因而高表達MMP-2、MMP-9從而獲得較強的侵襲活性。所以靶向c-maf基因的治療可通過下調ARK5進而降低MMP-2、MMP-9的水平，降低瘤細胞的侵襲力，從而降低患者體內瘤細胞負荷，減少髓外轉移、改善患者預后。

綜上所述，本實驗證實了通過沉默c-maf的表達可明顯抑制多發性骨髓瘤RPMI8226細胞的增殖及侵襲力并誘導其凋亡，結合c-maf在增強多發性骨髓瘤細胞粘附、遷移和血管發生等方面的作用，我們認為靶向c-maf的治療是可行的，將有可能成為MM基因治療的一種新的選擇。

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