活化血管內皮細胞檢測與非小細胞肺癌抗血管生成治療療效的相關性研究*

魏熙胤 王 晶 臧鳳琳 張 飛 劉竹君 張翠翠 李 凱

抗血管生成聯合化療可明顯延長非小細胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）的無進展生存期和總生存期而廣泛用于臨床。但此類藥物的特點在于抑制腫瘤生長，而非迅速縮小瘤體，在以腫瘤體積變化為基礎的評價體系中，其效果常被低估。因而，尋找有效的評估標志物已成為重要研究方向?？寡苌伤幬锏闹饕悬c為血管內皮細胞（circulating endothelial cells，CECs）。Beaudry等［1］證實荷瘤動物CECs變化與血管內皮抑素的抑瘤效果顯著相關。CECs的主要來源包括骨髓中的血管內皮前體細胞和周圍血管壁上的活化內皮細胞（activated CECs，aCECs）。其變化反應抗血管與促血管生成因子相互拮抗的最終結果，可能成為評估抗血管生成的有效標志物［2］。本研究應用流式細胞術檢測NSCLC中aCECs數量，分析aCECs與抗血管生成療效的關系，以期尋找反映抗血管生成療效的標志物。

1 材料與方法

1.1 一般資料

入組標準：經組織學或細胞學確診、局部晚期或轉移性NSCLC患者、未行化療或僅接受一線治療。其他條件包括：病灶單徑≥1 cm；身體狀況評分標準（ECOG）≤2分；預計生存期≥3個月；無生物制劑等藥物過敏史；患者自愿參加并簽署知情同意。排除標準：未控制的急性感染或腦轉移；嚴重心臟病史；明顯出血傾向；既往應用恩度治療等。選取2009年3月至2011年12月本院收治的142例NSCLC患者，均經病理組織學或細胞學檢查確診，其中男性88例，女性54例，年齡25～75歲。腺癌77例，鱗狀細胞癌49例，其他類型16例。TNM臨床分期：ⅢB期53例，Ⅳ期89例。另選取30例健康志愿者作為健康對照組，僅采外周血行CECs檢查而不行治療。此項研究經天津醫科大學倫理委員會批準。

1.2.1 治療方法 化療組71例：長春瑞濱聯合順鉑（NP方案）：長春瑞濱25 mg/m2，第1、8天；順鉑25 mg/m2，第2～4天。聯合組71例：NP方案聯合重組人血管內皮抑制素（恩度）：恩度7.5 mg/m2、第1～14天連續給藥，伴隨上述NP方案。所有藥物的給藥方式均為靜脈滴注，21～28天為1個周期，共6個周期，至有明確進展或出現不能耐受毒副作用時出組。

1.2.2 療效評定 依實體瘤療效評價標準判定治療效果，分為完全緩解（complete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、疾病穩定（stable disease，SD）和疾病進展（progression disease，PD）［3］?；颊哂诨熐?、化療期間每2個周期檢測強化CT、MRI或PET-CT，對SD及以上療效4周后確認，必要時隨時檢查。腫瘤進展時間（time to progression，TTP）為從隨機開始至疾病進展的時間。療效經由獨立的療效評估委員會再評估。

1.2.3 流式細胞術檢測aCECs 治療前3天內及每個周期治療后3天內取1 mL靜脈血，流式細胞術檢測研究對象血清aCECs水平和基線范圍：1）各取抗凝全血0.1 mL，分別加入實驗管和同型對照管。實驗管中加入FITC標記小鼠抗人CD105 10 μL、PE標記小鼠抗人CD146 10 μL、PE-Cy5標記小鼠抗人CD45 10 μL，對照管中分別加入FITC標記小鼠IgG1 10 μL、PE標記小鼠IgG1 10 μL、PE-Cy5標記小鼠IgG2a 10 μL，避光孵育30～45 min。所有試劑均購自美國貝克曼庫爾特公司。2）向上述管中各加入紅細胞裂解液Opti-Lyse C 0.5 mL，孵育15 min，加PBS常規清洗，離心后棄上清，加入0.5 mL鞘液，振蕩混勻待測。3）以標準熒光微球常規校準儀器的變異系數并穩定在2以內，運用邏輯設門方法（圖1）確定目標細胞，收集10萬個細胞，根據細胞發出的熒光測定表達率并計算CD45-CD105+CD146+細胞數［4-5］。4）計算aCECs的變化差值：差值=治療后值-治療前值。

1.2 方法

圖1 邏輯設門：在左圖中采集10萬個外周血細胞為研究背景；中圖縱坐標為CD45，橫坐標為CD146，其中左上相限和右上相限為CD45陽性細胞即白細胞予以排除，右下相限為CD146單陽性細胞；右圖縱坐標為CD146，橫坐標為CD105；右圖右上相限為CD146、CD105雙陽性細胞即活化血管內皮細胞（CD45-CD146+CD105+）Figure 1 Gating logic:The left illustration shows the gate used to exclude the platelets,dead cells,and debris.We collected 100,000 peripheral blood cells for study.In the middle illustration,the ordinate was CD45,and the abscissa was CD146.The upper left quadrant and upper right quadrant exhibit leukocytes,which were excluded,and the lower right quadrant illustrates CD146+cells.The ordinate of the right illustration was CD146,and the abscissa was CD105.The upper right quadrant shows CD45+CD146+CD105+cells,namely,aCECs

1.3 統計學分析

采用SPSS 18.0統計軟件進行數據處理，對計量指標計算均值、標準差、中位數、最小值、最大值，對分類指標計算各類別的例數及百分數。因aCECs為非正態分布，故取自然對數ln使之正態化后再進行計算。Cox回歸分析模型分析疾病進展風險比（hazards ratio，HR）、評價各因素對TTP、OS的影響。在Cox回歸中將aCECs差值按≤0分、0～10分、11～100分、＞100分為4個亞層，分別定義為aCECs1、aCECs2、aCECs3、aCECs4。雙側檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 療效

2.1.1 短期療效 2個周期后聯合組CR 0例，PR 10例，SD 48例，ORR、CBR分別為14.1%和81.7%；化療組CR 0例，PR 2例，SD 51例，ORR、CBR分別為2.8%和74.6%；兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.1.2 遠期療效 隨訪至2012年12月，聯合組與化療組中位TTP分別為7.3個月和5.3個月（P=0.038）。

2.2 aCECs治療中的變化及意義

2.2.1 基線情況 健康對照組基線范圍為（45，12～215）/105細胞，ln aCECs（1.7±0.3）；化療組基線范圍為（67，25～335）/105細胞，ln aCECs（4.4±1.7）；聯合組基線范圍為（75，35～390）/105細胞，ln aCECs（4.7±1.5）。對照組性別、年齡與臨床試驗患者間比較差異無統計學意義，aCECs數量明顯低于治療組（P=0.006）。兩試驗組間aCECs比較差異無統計學意義（P＞0.05），且與性別、年齡、病理類型及臨床分期均不相關（P＞0.05）。

2.2.2 治療中的變化 1）化療組aCECs變化：治療后第1、2、3、4個周期aCECs分別為（105，65～404）/105細胞，ln aCECs（4.5±1.8）；（175，125～470）/105細胞，ln aCECs（5.0 ±1.5）；（254，205～714）/105細 胞 ，ln aCECs（5.2± 1.9）和（110，150～480）/105細 胞 ，ln aCECs（4.8±1.9）。其中第3個周期數值與基線相比，明顯升高（P=0.040）。2）聯合組aCECs變化：除常規化驗外，聯合組患者于第 8、29、50、71天加驗aCECs。結果顯示：治療前、第8天、第1個周期后、第29天、第2個周期后、第50天、第3個周期后、第71天、第4個周期后aCECs分別為（77，42～314）/105細胞，ln aCECs（4.3±1.1）；（178，50～425）/105細胞，ln aCECs（5.2±1.7）；（46，9～522）/105細胞，ln aCECs（4.6±1.2）；（181，78～727）/105細胞，ln aCECs（5.2±1.5）；（126，62～256）/105細胞，ln aCECs（5.0±1.3）；（322，106～467）/105細胞，ln aCECs（5.5±0.9）；（100，44～131.3）/105細胞，ln aCECs（4.6±1.3）；（465，117～851）/105細胞，ln aCECs（5.9±1.2）和（180，68～744）/105細胞，ln aCECs（5.3±1.3）。其中，第8天、第29天、第2個周期后、第50天、第71天、第4個周期后aCEC均較基線明顯升高（P＜0.05），而其余聯合組各取血點aCECs變化較基線差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.2.3 aCECs數量與療效的相關性 化療組PD患者與非PD患者aCECs基線分別為（75，40～352）/105細胞，ln aCECs（4.2±1.6）和（55，25～290）/105細胞，ln aCECs（4.3±1.4）。聯合組PD患者與非PD患者aCECs分別為（59，25～110）/105細胞，ln aCECs（3.8±1.7）和（65，24～285）/105細胞，ln aCECs（4.3±1.8）。不同治療組內PD與非PD患者的aCECs數量比較差異均無統計學意義。通過比較治療前、后aCECs變化發現，PD患者與非PD患者在化療或聯合治療后，aCECs均較治療前有所升高，但僅PD患者aCECs數量變化差異有統計學意義（化療組，P=0.041；聯合組，P=0.020）。

化療聯合恩度治療患者非PD與PD組aCECs數值分別為（65，40～190）/105細胞，ln aCECs（4.2±1.3）和（75，50～214）/105細胞，ln aCECs（3.8±1.5），兩者差異亦無統計學意義（P＞0.05）。但在不同治療方式中，PD患者于治療后aCECs升高差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.2.4 兩組不同療效患者aCECs波動情況 1）化療組中PD病例平均治療2個周期，治療前aCECs為（75，40～352）/105細胞，ln aCECs（4.2±1.6）；2個周期后為（170，150～570）/105細胞，ln aCECs（5.3±1.7），較基線明顯升高（P=0.041）。非PD病例平均治療3個周期，治療前 aCECs為（55，25～290）/105細胞，ln aCECs（4.3±1.4）；第3個周期后為（45，10～300）/105細胞，ln aCECs（4.6±1.5），aCECs升高與基線相比差異有統計學意義（P=0.033）。2）聯合組中PD病例平均治療2個周期，治療前及1、2個周期后aCECs值分別為（59，25～100）/105細胞，ln aCECs（3.8±1.7）；（155，55～300）/105細胞，ln aCECs（4.6±1.6）；（240，70～680）/105細胞，ln aCECs（5.2±1.8），治療后較基線升高差異均有統計學意義（P＜0.05）。非PD病例平均治療3個周期，治療前、后aCECs變化差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2.5 aCECs與TTP的相關性 相關性研究顯示，在聯合組中治療后aCECs的變化差值與TTP間呈負相關（r=-0.351，P=0.039），而化療組兩者間無任何相關性（r=-0.205，P=0.372，圖2）。Cox回歸結果顯示aCECs的差值是反映聯合組TTP的重要因素（表1）。

圖2 aCECs差值與TTP的相關性Figure 2 Correlation between△aCECs and TTP

3 討論

晚期NSCLC患者的治療以化療為主，但雙藥含鉑方案平均生存時間僅為7～9個月，而且腫瘤復發仍難以避免［6］?？寡苌伤幬锱c化療聯合首次將其平均生存期延長至1年以上［7］。其中，血管內皮抑素作用效果最為確切，多個臨床試驗已證明其對雙藥聯合化療有明顯的增效作用［8］。但此類藥物的靶點是腫瘤血管，在短時間內多無法迅速縮小腫瘤體積，單靠測量腫瘤大小往往會低估藥物的療效，臨床急需尋找有效的早期標志物，以盡早評價腫瘤對抗血管治療的反應。本研究組對此問題進行了研究，并初步推測aCECs在抗血管生成療效的評判中具有重要價值。

表1 aCECs差值與NSCLC患者TTP間的相關性Table 1 Correlation between△aCECs and TTP

3.1 aCECs的流式檢測標記

CECs是外周血中可檢測到的血管內皮細胞總稱，在正常人血中含量極少，但在炎癥、免疫應答、腫瘤等疾病狀態下數量明顯增加。CECs起源于現有血管壁的成熟內皮細胞和骨髓的內皮祖細胞，以及由腫瘤細胞轉化成的有功能的內皮細胞。成熟的CECs經促血管生成因子激活后，進入血液循環并轉變為活化血管內皮細胞（activated CECs，aCECs），遷移至腫瘤處參與形成新生血管。aCECs升高可直接反應促血管與抗血管生成因子的對抗平衡，監測其水平可能有助于預測抗血管生成療效［9-10］。本研究組曾應用流式細胞術檢測外周血中的aCECs，將CD45-CD146+CD105+作為其界定標志［4-5，9］。本研究表明，與健康對照者比較，以CD45-CD146+CD105+界定的aCECs在肺癌患者中明顯升高，初步驗證了本研究前期基礎實驗所確定的aCECs標記的可靠性。

3.2 aCECs在治療中的動態變化

aCECs的動態變化一直存在爭議。Beuadry等［1］研究VEGFR抑制劑ZD6474時發現，ZD6474可以使CECs升高，同時微血管密度下降、瘤體減小。Li等［11］發現經沙利度胺聯合多西紫杉醇治療后，前列腺癌中凋亡CECs和aCECs均表現升高趨勢。Kawaishi等［12］觀察到經紫杉醇聯合卡鉑治療后肺癌患者第8天及第22天aCECs較治療前下降。本研究組觀察到化療聯合恩度治療非小細胞肺癌有效病例中aCECs的數目顯著下降［9］。故在有效的抗血管生成聯合化療過程中，aCECs應呈現“先升后降”的數量變化趨勢。首先，恩度抑制基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），使腫瘤血管基底膜降解減少、血管通透性下降，降低局部組織間質液壓，使膨脹的血管收縮，血管內壁上的內皮細胞被“擠脫”下來于血循環中，致使aCECs數目升高。隨后，細胞毒藥物誘導aCECs凋亡，而隨著腫瘤體積縮小，腫瘤血管生長因子（TAFs）及aCECs越來越少。因此aCECs開始的升高反映了腫瘤血管床面積的縮小，最終的下降則提示CECs凋亡和腫瘤新生血管能力的削弱。本研究化療組和聯合組治療中aCECs均有升降，說明CECs在治療中始終處于動態升、降狀態，正是“血管正?；睂е缕渖仙驼T導凋亡導致其下降動態的平衡表現［13］。有研究提出，“血管正?；弊饔脙H出現于抗血管生成治療后的1～2周，是一過性的，后面即轉入抑制腫瘤血管而導致其退縮和“血管缺乏化”［14-15］。本研究認為，由于治療中的多次、周期性用藥，兩種作用應是交替共存的，治療有效者的aCECs也表現為下降中的反復波動。而隨著治療延長，腫瘤細胞生物活性不斷降低、TAFs減少，瘤內血管床面積和CE-Cs也會最終明顯降低并穩定。

3.3 aCECs與療效的關系

本研究中化療組及聯合組PD患者治療后aCECs數量均較治療前升高（P=0.041，P=0.020），其差值的變化方向（上升或下降）與幅度可以反映療效的優劣。有效治療使腫瘤縮小、內皮細胞凋亡，aCECs必然最終下降。反之，若治療無效，新血管不斷生長，aCECs也會不斷升高。對其一過性的升高或降低需結合臨床及CT檢查結果評價，適時調整治療方案。相關性研究顯示聯合組aCECs治療前、后的變化差值與TTP間呈明顯負相關（r=-0.351，P=0.039），提示經過長時間的有效治療后，aCECs最終將會下降并保持在較低水平。

綜上所述，在晚期NSCLC患者的外周血中可以檢測到aCECs，在腫瘤進展時其呈持續上升，而治療有效時則呈波動下降趨勢，對此部分病患者繼續治療可獲得長期腫瘤穩定。短時間內的“血管正?；笨梢餋ECs的一過性升高。aCECs有望用于判定NSCLC抗血管生成聯合化療效果。

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