非小細胞肺癌EGFR基因突變的臨床意義研究*

鄭 軍 謝貴元 李 姣 羅佳娣 文秋元 范松青

肺癌是導致癌癥患者死亡的主要惡性腫瘤之一，非小細胞肺癌占肺癌80%～85%。盡管手術和放化療技術不斷提高，但非小細胞肺癌患者的5生存率仍低于20%［1-3］。近年來以表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）為靶點的分子靶向治療已成為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）一種新的治療方案，然而只有部分患者對表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）Gefitibib和Erlotinib藥物敏感。研究證實：EGFR體細胞突變對Gefitibib和Erlotinib藥物治療后的潛在臨床反應起決定作用，EGFR TKI結構域的前4個外顯子（外顯子18～21）發生突變的患者對Gefitibib和Erlotinib藥物的反應性更好［4-6］。本研究檢測NSCLC患者EGFR基因突變情況，旨在探討EGFR突變與非小細胞肺癌臨床病理特征的關系，為后續臨床的個體化靶向治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 標本收集

標本來源于湘雅二醫院病理科2010年1月至2012年12月期間經肺穿刺（146例）和外科手術切除（68例）的214例非小細胞肺癌患者，全部病例術前未經放化療。其中男性114例、女性100例，年齡≥60歲為96例、＜60歲為118例，WHO病理組織學分型：肺腺癌185例，鱗狀細胞癌29例。本研究經醫院倫理委員會審查批準，取得患者同意，符合倫理標準。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 每一標本從石蠟包埋的腫瘤組織中切取5～6 μm厚的切片，5～10片放入1.5 mL Eppendorf管中，加適量二甲苯進行脫蠟，然后加入適量乙醇洗脫二甲苯，室溫或37℃晾干，直到乙醇完全蒸干；加入180 μL Buffer ATL，再加入20 μL蛋白酶K，震蕩混勻；56℃消化過夜，直至樣品完全裂解；用OIAamp DNA FFPE Tissue試劑盒提取DNA。

1.2.2 基因突變檢測 利用ADx-ARMS?試劑盒（廈門艾德）進行EGFR基因突變檢測。

1.3 統計學分析

EGFR基因位點的陽性突變率與肺癌臨床病理特征的相關性，利用SPSS 12.0統計軟件進行χ2檢驗或Fisher精確檢驗，以雙側檢驗水準P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 非小細胞肺癌EGFR基因突變分析

突變擴增阻滯系統（amplification refractory mutation system，ARMS）檢測非小細胞肺癌EGFR基因突變。214例非小細胞肺癌EGFR基因總突變率為45.8%（97/214）。其中外顯子18突變率為0.93%（2/214）、外顯子19突變為22.0%（47/214）、均為缺失突變；外顯子20突變率為2.3%（5/214），其中4例為缺失突變，1例EGFR基因T790M突變；外顯子21突變率為20.6%（44/214），均為EGFR基因L858R突變；另有2例患者為EGFR基因外顯子19和21雙重突變（表1）。

2.2 EGFR基因突變情況與患者臨床病理特征的關系

EGFR基因在肺腺癌組織中的突變率為50.3%（93/185）明顯高于肺鱗狀細胞癌17.2%（5/29）（P=0.001）；EGFR基因在女性患者中的突變率57.0%（57/100）高于男性36.0%（41/114）（P=0.002）；EGFR基因突變率與患者的年齡無顯著性差異（表2）。

本研究進一步分析68例手術切除的NSCLC的EGFR基因突變與淋巴結轉移、腫瘤分化程度和肺癌臨床分期的關系。EGFR基因在NSCLC淋巴結轉移患者中的突變率（66.7%）顯著高于無淋巴結轉移患者（39.5%）（P＜0.05），但EGFR基因突變率與NSCLC患者腫瘤分化程度及臨床分期均差異無統計學意義（P＞0.05，表3）。

表1 214例非小細胞肺癌患者EGFR基因突變分析Table 1 Analysis of EGFR gene mutations in 214 cases of NSCLC

表2 EGFR基因突變與非小細胞肺癌患者臨床病理特征的關系Table 2 Association between the EGFR gene mutations and clinicopathological features of NSCLC

表3 EGFR基因突變與68例手術切除非小細胞肺癌患者臨床病理特征的關系Table 3 Association between the EGFR gene mutations and clinicopathological features in 68 cases of surgically resected NSCLC

3 討論

EGFR是一種跨膜受體型酪氨酸激酶，在NSCLC中存在過表達和（或）發生突變。靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制劑Gefitinib為進展期NSCLC的臨床一線用藥，肺癌患者EGFR酪氨酸激酶編碼區基因突變是EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）靶向治療的一個必要前提條件［4-5］。目前，突變擴增阻滯系統（ARMS）已成為國際上腫瘤個體化分子檢測最重要、最先進的技術之一，其在臨床應用中的優勢已被業內專家廣泛認可。ARMS技術利用特異引物對突變靶序列進行高精準PCR擴增放大，與此同時，利用探針對擴增產物進行檢測，在實時熒光定量PCR平臺上實現對樣品DNA中稀有突變的檢測，以達到對基因突變檢測的高特異性和高靈敏度。ARMS方法檢測靈敏度明顯高于直接測序法等其他方法。

EGFR基因突變主要在亞洲、腺癌、女性、非吸煙者占優勢，與Gefitinib靶向治療NSCLC患者的臨床療效分布相似［4］。本研究結果顯示，國內NSCLC患者EGFR基因的總突變率（45.8%）與日本、中國臺灣及印度地區相接近，明顯高于西方人群［6-8］。腺癌是NSCLC最常見的組織類型，本研究中肺腺癌EGFR基因突變率為50.3%（P=0.001），高于韓國［9］（36.4%）和對中國大陸1 195例患者評估中肺腺癌EGFR基因突變的檢出率（38.1%）［10］。這可能與ARMS方法檢測靈敏度高，而且可以對原來未能檢測出陽性結果的小樣本增加檢出率有關。性別是NSCLC中EGFR基因突變的臨床預測因素之一，本研究結果與亞洲和西方國家的研究報道相一致，女性同樣有較高的突變率［6-10］。本研究進一步證實亞洲腺癌患者和女性非小細胞肺癌EGFR的突變率總體較高，是EGFR-TKI靶向治療的優先人群。

EGFR基因共28個外顯子，其中編碼酪氨酸激酶區的是第18～21外顯子。研究表明EGFR基因突變部位分散在整個酪氨酸激酶區，19外顯子的缺失突變和21外顯子的L858R突變是最常見的突變類型［4-6］。本研究結果顯示這2個外顯子的突變率累計為42.6%。提示19外顯子和21外顯子易受環境致癌物的攻擊，突變后可能進一步激活EGFR信號轉導通路，在NSCLC的發生、發展中可能起重要的作用。此外，研究中還觀察到2例19外顯子的缺失突變和21外顯子的L858R突變的雙重突變，這一現象提示肺癌患者中也存在EGFR基因聯合突變的發生。同時觀察到5例罕見的20外顯子突變，突變后可能改變了酪氨酸激酶區ATP結合囊的構象，從而增強了ATP與EGFR的親和性，使腫瘤細胞對EGFR-TKIs產生抵抗性，這一突變主要見于EGFR-TKIs治療后復發者［9-13］。

藥物療效與腫瘤的淋巴結轉移、臨床分期及腫瘤病理分級密切相關。多數研究報道顯示，EGFR基因在NSCLC淋巴結轉移患者中的突變率高于無淋巴結轉移患者，而與腫瘤臨床分期及病理分級無顯著性相關［14-16］。本研究同樣發現EGFR基因在NSCLC淋巴結轉移患者中的突變率顯著高于無淋巴結轉移患者，但EGFR基因突變率與NSCLC患者的腫瘤分化程度及臨床分期均無統計學意義。這一結果提示Gefitinib可能對EGFR基因突變的不同分化程度和不同臨床分期的肺癌患者有同樣的藥物療效，本結果需要擴大樣本量進一步研究證實。

總之，中國非小細胞肺癌患者EGFR基因突變率較高，肺腺癌是主要的突變類型。檢測EGFR外顯子19和21突變并結合臨床病理特征有望成為評估TKI治療NSCLC患者療效的分子標志。

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