膠質瘤細胞中ADAR2 mRNA前體選擇性剪接模式的分析*

李朝暉 田 男 魏 君 李小玲 杜 超 李妍哲 田 宇

·基礎研究·

膠質瘤細胞中ADAR2 mRNA前體選擇性剪接模式的分析*

李朝暉①田 男②魏 君①李小玲②杜 超①李妍哲①田 宇①

目的：比較膠質瘤細胞U87、U251、A172和正常星形膠質細胞HA1800中ADAR2 mRNA前體選擇性剪接模式的差異。方法：RFPCR產物測序檢測膠質瘤細胞和正常膠質細胞中GluR2 Q/R位點的A-to-I編輯水平。根據前期研究鑒定出的選擇性剪接位點設計特異性引物，RT-PCR方法檢測膠質瘤細胞U87、U251、A172和正常星形膠質細胞HA1800中不同剪接轉錄本的相對表達量，比較膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞中ADAR2 mRNA前體剪接模式的差異。結果：膠質瘤細胞中GluR2 Q/R位點的A-to-I編輯水平明顯下降。RT-PCR檢測到在膠質瘤細胞中，Exon 1a（+）/1a（-）、Exon 2（+）/2（-）的比值在膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞中無顯著性差異。Exon 5a（+）/5a（-）的比值明顯高于正常星形膠質細胞HA1800。結論：Exon 5a位點的剪接在膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞中有顯著性差異，Exon 5a（+）轉錄本的表達增加可能是導致膠質瘤細胞中ADAR2編輯活性下降的原因。

膠質瘤 RNA編輯 選擇性剪接

1Department of Neurosurgery,Sino-Japanese Union Hospital of Jilin University,Changchun 130031;2Department of Cell Biolo

gy,Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine School of Life Science,Hangzhou 310053,China

This work was supported by grants from the Jilin Provincial Science and Technology Development Plan for International S&T Co

operation Program(No.20130413028GH)

RNA編輯是一種重要的RNA轉錄后加工過程，其中最為常見的是A-to-I編輯，A-to-I RNA編輯具有重要的生理作用，該過程的異常與多種疾病有關［1-3］。其中谷氨酸受體GluR2 Q/R位點編輯效率的下降與膠質瘤的發生發展有關。A-to-I RNA編輯由RNA編輯酶ADAR2介導，ADAR2 mRNA的表達水平在不同的研究中結果不一致，存在ADAR2 mRNA表達水平不隨GluR2 Q/R位點的編輯效率下降而同步下降的現象［4-7］。在前期研究中，檢測到在膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞中，存在3個位點的選擇性剪接。因此，推測ADAR2 mRNA前體選擇性剪接模式變化引起的ADAR2活性的改變可能與膠質瘤中A-to-I RNA編輯效率下降有關。本研究旨在比較膠質瘤細胞株和正常星形細胞中ADAR2選擇性剪接模式的差異，探討膠質瘤細胞中ADAR2編輯活性下降的原因。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

人膠質瘤細胞株U87、U251、A172和人星形膠質細胞HA1800均購自中科院上海細胞所。

DMEM高糖培養基、含EDTA胰酶購于南京凱基生物科技發展有限公司。胎牛血清（FBS）購自杭州四季青。Trizol試劑由美國Invitrogen公司提供。SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒、GoldStar Best Taq DNA Polymerase、Quick DNA Purification Kit快速DNA產物純化試劑盒、Ultra SYBR熒光定量PCR試劑盒均購于北京康為世紀生物科技有限公司。PCR擴增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

美國Quawell超微量紫外分光光度計，德國Eppendorf PCR儀，美國Bio-Rad Chromo4多色實時熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HA1800、U87、U251和A172用含10%胎牛血清、青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL的DMEM培養液，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養。

1.2.2 RT-PCR及基因測序檢測GluR2 Q/R位點的編輯效率 處理后細胞溶于1mL Trizol溶液，提取細胞總RNA。SuperRT cDNA Kit試劑盒合成cDNA。GoldStar Best Taq DNA Polymerase擴增包含GluR2 Q/R位點的DNA片段。primer F：5'-ACCCTTGTGAGAGAAGAGGTGAT T-3'，primer R：5'-TGGAGCCAGAGTCTAATGTTCCA T-3'。反應體系為50 uL，包括5×GoldStar Best Taq PCR Buffer 10uL，dNTP Mix（2.5 mM）4 μL，GoldStar Best Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.5 μL，cDNA 2 μL，primer F（10 μmol/L）1 μL，primer R（10 μmol/L）1 μL，添加去離子水使總體積達到50 μL。RT-PCR反應條件：95℃，10 min；94℃、30 s，57℃、30 s，72℃、60 s，40個循環；72℃，10 min。Quick DNA Purification Kit快速DNA產物純化試劑盒回收PCR產物，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。測序工作由上海生工生物工程有限公司完成。計算GluR2 Q/R位點A、G的峰值，Q/R位點A-to-I編輯效率=G/（A+G）×100%。

1.2.3 實時熒光定量PCR 處理后細胞溶于1 mL Trizol溶液，提取細胞總RNA。SuperRT cDNA Kit試劑盒合成cDNA。根據剪接位點設計特異性引物分別擴增ADAR2的不同的選擇性剪接轉錄本（表1）。反應體系包括1 μL cDNA，primer F 1 μL，primer R 1 μL，2×SYBR 12.5 μL，添加去離子水使總體積達到25 μL。β-actin作為內參。PCR環境設定在95℃10 min，依下列程序進行40個循環：95℃，15 s；56℃，30 s；72℃，30 s。每個樣本設3個復孔，每組實驗重復3次。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差（±s）表示。組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膠質瘤細胞中GluR2 Q/R位點A-to-I編輯效率的檢測

HA1800細胞中，GluR2 Q/R位點A-to-I編輯效率為100%，膠質瘤細胞株U87、U251及A172中，GluR2 Q/R位點A-to-I編輯效率分別為92%、89%、83%。膠質瘤細胞中GluR2 Q/R位點A-to-I編輯效率較正常膠質細胞均不同程度下降（圖1）。

2.2 膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞中ADAR2 mRNA表達水平的檢測

Real-time PCR檢測到膠質瘤細胞U87、U251、A172中總ADAR2 mRNA表達較正常星形細胞HA1800無明顯改變（P＞0.01，圖2）。

2.3 膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞中ADAR2選擇性剪接模式差異的比較

Real-time PCR檢測到在膠質瘤細胞中，Exon 1a（+）/1a（-）、Exon2（+）/2（-）的比值在膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞中無差異（P＞0.01，圖3A，3B）。Exon 5a（+）/5a（-）的比值明顯高于正常星形膠質細胞HA1800（P＜0.01，圖3C）。

3 討論

A-to-I RNA編輯具有重要的生理作用，該過程的異常與多種疾病的發生發展有關。其中谷氨酸受體GluR2 Q/R位點編輯通過調節CDC14B/Skp2/p21/ p27通路抑制膠質瘤的生長，在膠質瘤中檢測到GluR2 Q/R位點編輯效率明顯下降［8］。證實GluR2 Q/R位點編輯效率在膠質瘤細胞U87、U251、A172中分別為92%、89%、83%，較正常星形膠質細胞100%明顯下降。

A-to-I RNA編輯由RNA脫氨基酶ADAR2介導，ADAR2由3部分構成：雙鏈RNA結合域（double-strand RNA binding domain，dsRBD），位于催化域的上游，對于特異識別和結合RNA底物起決定性作用；dsRBD上游的N端結構域；位于蛋白的C末端的催化脫氨基結構域，在催化反應中以鋅作為親核試劑與水相互作用。ADAR2基因全長為152 Kb，包含14個外顯子，其中dsRBD由外顯子2編碼，催化脫氨基結構域由外顯子4、5、6編碼［9］。

人類ADAR2 mRNA前體存在復雜的選擇性剪接，在ADAR2基因的5'-非編碼區（5'-untranslated region，5'-UTR）、雙鏈RNA結合域、催化脫氨基結構域和3'-UTR均存在選擇性剪接位點。文獻中已經發現的選擇性剪接位點有8個，通過選擇性剪接產生至少96種選擇性剪接異構體（alternative splicing variants，ASVs）。ADAR2 mRNA前體在不同的組織、個體發育的不同階段表現為不同的剪接模式［10-13］。

以往的研究顯示，在膠質瘤中，ADAR2 mRNA的表達水平在不同的研究中結果不一致，且存在ADAR2 mRNA表達水平不隨GluR2 Q/R位點的編輯效率下降而同步下降的現象。Mass等［4］檢測到膠質瘤組織及細胞株中GluR2 Q/R位點編輯效率下降，但ADAR2 mRNA水平與正常腦白質比較無明顯變化。Paz等［5］檢測12例正常腦組織和18例膠質瘤組織的ADAR2 mRNA表達水平，發現與正常腦組織相比，膠質瘤組織中ADAR2 mRNA表達水平下降。Cenci等［6］檢測10例兒童膠質瘤組織及腫瘤周圍白質的ADAR2mRNA表達水平，發現膠質瘤組織中ADAR2 mRNA表達水平無明顯變化。這種GluR2 Q/R位點的編輯效率下降和ADAR2 mRNA表達水平不同步下降的現象尚未能解釋。

在之前的研究中，人正常星形膠質細胞HA1800和膠質瘤細胞U87、U251、A172中鑒定出ADAR2 mRNA前體存在3個選擇性剪接位點。第1個剪接位點位于外顯子-1和外顯子1之間，產生Exon 1a；第2個剪接位點位于編碼dsRBD的區域，引起整個Exon 2的缺失，產生提前終止密碼子，導致mRNA的無義降解；第3個剪接位點位于編碼催化脫氨基結構域的區域，引起Exon 5a（Alu重復序列，120個堿基）的插入，產生編輯活性下降的ADAR2［12-13］。這3個位點的選擇性剪接均能對ADAR2的編輯活性產生影響。利用RT-PCR檢測膠質瘤細胞和正常細胞中ADAR2 mRNA總的表達量，并分別比較由3個選擇性剪接位點產生的選擇性剪接轉錄本表達水平的差異。結果顯示，膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞中，ADAR2 mRNA總的表達量無明顯差別。在第1和第2個剪接位點，膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞的剪接模式無明顯差異。在第3個剪接位點，膠質瘤細胞表現為Exon5a（+）轉錄本優勢表達，而在正常星形膠質細胞中，Exon5a（-）轉錄本優勢表達。

基因的選擇性剪接異常與多種腫瘤的發生發展密切相關，選擇性剪接可通過影響腫瘤細胞的細胞周期調節、信號轉導通路、凋亡、血管生成、侵襲和轉移等參與腫瘤的發生發展過程［14-15］。結合研究結果，A-to-I RNA編輯的效率不僅與ADAR2總的表達量有關，也受選擇性剪接的調節。在膠質瘤細胞中，ADAR2 mRNA的表達量無明顯改變，但由于選擇性剪接異常導致Exon5a（+）的轉錄本表達占主導地位，產生活性較低的ADAR2，引起膠質瘤細胞中GluR2 Q/R位點A-to-I RNA編輯水平下降。

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（2013-12-02收稿）

（2014-02-24修回）

（本文編輯：周曉穎）

Analysis of alternative splicing pattern of ADAR2 pre-mRNA in human glioma cell lines

Zhaohui LI1,Nan TIAN2,Jun WEI1,Xiaolin LI2,Chao DU1,Yanzhe LI,Yu TIAN1
Correspondence to:Yu TIAN;E-mail:tianyu2801@126.com

Objective:This study aims to analyze the differences in the alternative splicing pattern of ADAR2 among glioma cell lines U87,U251,A172,and normal human astrocyte HA1800.Methods:A-to-I editing level at the Q/R-Site of GluR-2 was analyzed by RT-PCR and sequencing.Real-time PCR was performed to detect the expression level of each alternatively splicing variant using a specific primer that was confirmed to amplify only the targeted template and not other alternatively spliced variant fragments.Results:We verified that the Q/R-Site of GluR-2 is under-edited in glioma cell lines.Real-time PCR revealed that the ADAR2 pre-mRNA splicing pattern has no significant difference at exons 1a and 2 between glioma cell lines and normal human astrocyte.We also detected that the amount of alternative splicing variants,including exon 5a,was higher than that of alternative splicing variants not including exon 5a in human glioma cell lines.However,the expression of alternative splicing variants,including exon 5a,was lower than that of alternative splicing variants not including exon 5a in human astrocyte.Conclusion:Evident differences in splicing were observed at the site of exon 5a between glioma cell lines and normal human astrocytes.The difference in the alternatively splicing pattern at exon 5a may be attributed to the decreased activity ofADAR2.

glioma,RNAediting,alternative splicing

10.3969/j.issn.1000-8179.20132046

李朝暉 博士，主治醫師。研究方向為膠質瘤的發病機制和基因治療。

①吉林大學白求恩醫學部中日聯誼醫院神經外二科（長春市130031）；②浙江中醫藥大學生命科學學院

*本文課題受吉林省科技發展計劃國際科技合作項目（編號：20130413028GH）資助

田宇 tianyu2801@126.com

E-mail：tianyu2801@126.com