腫瘤疫苗聯合節拍化療對小鼠乳腺癌作用的研究*

史業輝 周立艷 魏 楓 于津浦 賈勇圣 佟仲生

腫瘤疫苗聯合節拍化療對小鼠乳腺癌作用的研究*

史業輝 周立艷 魏 楓 于津浦 賈勇圣 佟仲生

目的：研究新型腫瘤疫苗聯合節拍化療對晚期乳腺癌小鼠模型的治療效果，并探討其作用機制。方法：以小鼠乳腺癌細胞系4T1接種Balb/c小鼠建立模型。利用含高遷移率核小體蛋白1（high-mobility group nucleosome binding protein 1，HMGN1）基因的重組質粒轉染4T1細胞，制備瘤苗。小鼠皮下接種4T1細胞，隨機分成生理鹽水對照組（NS組）、吉西他濱節拍化療組（MET組）、瘤苗組、節拍化療聯合瘤苗組（聯合組）4組。觀察各組小鼠腫瘤生長及不良反應，并檢測腫瘤局部調節性T細胞（regulatory T cells，Tregs）的Foxp3表達及腫瘤微血管密度（microvessel density，MVD）的變化。結果：聯合組腫瘤體積明顯小于MET組及瘤苗組（P＜0.05），與NS組比較有顯著性差異（P＜0.001）。Western blot和免疫組織化學檢測發現，聯合組與MET組小鼠腫瘤局部浸潤Tregs的Foxp3表達及腫瘤MVD明顯減少（P＜0.05）。各治療組未出現明顯的不良反應。結論：HMGN1基因修飾的新型瘤苗聯合吉西他濱節拍化療在乳腺癌小鼠模型治療中療效顯著且耐受性良好。

腫瘤疫苗 HMGN1 節拍化療 調節性T細胞 Foxp3

Department of Breast Oncology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,The National Clinical Research Center

of Cancer;Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy,Tianjin Medical University,Ministry of Education;Tianjin

Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,and Key Laboratory of Cancer Immunology and Biotherapy,Tianjin,Tianjin

300060,China

This study was supported by the Key Anticancer Technologies R&D Program of Tianjin(No.12ZCDZSY16200),the Scientific

Foundation of Tianjin Health Bureau(No.2010KZ76),and Development Funds for Scientific Projects of Colleges and Universi

ties in Tianjin(No.20100116)

晚期乳腺癌患者常因接受多療程、多方案化療對多種化療藥物已耐藥，且骨髓儲備功能較差不能耐受常規劑量化療，是臨床乳腺癌治療的難題。新興的生物治療特別是乳腺癌瘤苗無疑為晚期乳腺癌患者的治療帶來了希望，而乳腺癌瘤苗療效受多種因素影響，目前研究熱點主要在如何增強瘤苗免疫療效及克服體內抑制因素。警報素（alarmins）是一類具有樹突狀細胞（dendritic cell，DC）募集和活化雙重作用的內源因子［1］，可作為瘤苗強有力的佐劑，其中高遷移率核小體蛋白1（HMGN1）為alarmins家族中重要成員之一。節拍性化療（metronomic chemotherapy，MET）是指持續性、小劑量、高頻率使用細胞毒性藥物，中間無間歇期的一種化療方式［2］。Son等［3］研究表明節拍化療與免疫治療及放療聯合，顯著提高小鼠結腸癌生存期，機制主要是通過降低調節性T細胞水平。本研究通過構建HMGN1分泌表達的乳腺癌瘤苗并聯合節拍化療治療小鼠晚期乳腺癌，并初步探討二者協同作用機制，為晚期乳腺癌解救治療及乳腺癌生物化療治療模式提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

Balb/c小鼠，雌性，4～6周齡，平均體質量20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，SPF級條件下飼養，符合倫理委員會認可。小鼠乳腺癌細胞系4T1為本院免疫室保存。吉西他濱購自Lilly France公司，Foxp3抗體購自Ebioscience公司，CD34抗體購自Novus公司，Lipofectamine 2000TM購自Invitrogen公司。RPMI 1640培養液、胎牛血清（FBS）、0.25%胰酶消化液和青霉素/鏈霉素購自Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠乳腺癌瘤苗的制備 利用含HMGN1基因的重組質粒，以脂質體法轉染生長狀態良好的4T1細胞。24、48 h后采用TCA-丙酮沉淀法提取細胞上清蛋白，Western blot檢測HMGN1蛋白的分泌，以分析轉染效率。收集分泌量達到使用標準的4T1細胞，給予致死量（30 Gy）放射線照射，制備乳腺癌瘤苗。

1.2.2 荷瘤小鼠模型的建立及分組 正常Balb/c小鼠隨機分成4組，5只/組。將對數生長期的4T1細胞調整細胞濃度至5×107/mL，接種0.1 mL于每只小鼠右側腹股溝皮下，每日觀察腫瘤形成情況。捫及腫瘤直徑為6～9 mm時隨機分為4組：1）節拍化療聯合瘤苗組（聯合組）：每只小鼠腹腔注射吉西他濱（gemcitabin，GEM）10 mg/kg，每3天1次，持續至第21天；化療第8天，于腫瘤對側皮下注射瘤苗細胞（1×106個/只），7 d后加強免疫1次；2）單純瘤苗組（瘤苗組）：只給予瘤苗免疫治療，聯合組化療7 d后，本組小鼠腫瘤注射瘤苗；3）單純吉西他濱節拍化療組（MET組）：只給予小劑量吉西他濱治療；4）生理鹽水對照組（NS組）：采用生理鹽水腹腔內和皮下注射。各組用量用法均參照聯合組。

1.2.3 組織取材及免疫印跡和免疫組織化學檢測 上述動物實驗中，在接種腫瘤后第31天，測量小鼠腫瘤的大小，頸椎脫臼法處死小鼠。無菌條件下完整剝離瘤組織，生理鹽水沖洗后電子天平稱重，將瘤組織切成小塊，部分置于常溫下10%中性福爾馬林浸泡24 h。常規石蠟包埋后4 μm連續切片，免疫組織化學檢測Foxp3、CD34；另一部分置于液氮中，提取蛋白后Western blot法檢測Foxp3表達。

1.2.4 結果判定 成瘤后隔日測量小鼠體質量和腫瘤最長徑（a）及與之垂直的橫徑（b），根據公式V= 1/2ab2計算移植瘤體積，繪制移植瘤生長曲線。實驗過程中注意觀察小鼠皮毛色澤、食欲及活動變化。Foxp3判定：Foxp3是Tregs發育、活化、發揮功能的關鍵基因，為叉狀頭/翼狀螺旋轉錄因子，細胞核著色為陽性結果。對每張切片隨機計數5個高倍視野（×400）陽性細胞數，取平均值。MVD判定：以CD34單抗作為特異血管內皮細胞表面抗體檢測MVD，按照Weidner等［4］判定標準計數。

1.3 統計學處理

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料以均值±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HMGN1基因修飾瘤苗的構建

Western blot檢測轉染24、48 h后細胞上清蛋白（各兩個樣品），結果顯示均有HMGN1蛋白的分泌（圖1），符合瘤苗構建要求。

2.2 各組小鼠乳腺癌移植瘤生長的抑制效應

各組小鼠體質量、皮毛、食欲、行為等一般情況均未出現與治療有關的改變。治療前及治療早期各組小鼠皮下移植瘤體積差異無統計學意義（P＞0.05）；治療第13天NS組移植瘤體積與各治療組比較差異有統計學意義（P＜0.05），但各治療組間差異無統計學意義（P＞0.05）；治療結束后，NS組腫瘤體積為（3201.1±657.2）mm3、MET組腫瘤體積為（2010.6± 439.3）mm3、瘤苗組腫瘤體積為（2432.1±527.8）mm3、聯合組腫瘤體積為（1292.8±364.9）mm3。聯合組移植瘤體積與NS組比較有顯著性差異（P＜0.001），與MET組或瘤苗組比較亦有顯著性差異（P＜0.05），而MET組和瘤苗組間比較差異無統計學意義（P=0.209）（圖2）。各組瘤重比較與以上結果相似（圖3）。

2.3 吉西他濱節拍化療降低免疫抑制細胞的檢測

Western blot結果顯示，各組小鼠腫瘤組織均表達Foxp3蛋白，采用蛋白條帶和β-actin的灰度值比值評價，MET組及聯合組比值明顯低于NS組及瘤苗組，差異有統計學意義（P＜0.05）。免疫組織化學結果顯示NS組、MET組、瘤苗組、聯合組小鼠腫瘤組織均能觀察到Foxp3陽性淋巴細胞，陽性細胞數分別是（40.8±8.3）個/HP、（13.8±4.4）個/HP、（34.2±5.1）個/ HP、（14.4±4.3）個/HP。分析結果顯示NS組與含小劑量吉西他濱化療組（MET組及瘤苗組）差異有統計學意義（P＜0.001），與瘤苗組比較差異無統計學意義（P=0.089，圖4～5）。

2.4 節拍化療對腫瘤血管新生的影響

MET組（11.4±5.80）與聯合組（12.8±4.60）的MVD計數明顯低于NS組（30.0±3.54）和瘤苗組（24.0± 3.81）（P＜0.001），而兩組間MVD計數差異無統計學意義（P=0.633），NS組和瘤苗組MVD計數差異也無統計學意義（P=0.053）。

3 討論

本研究通過建立小鼠晚期乳腺癌模型，利用乳腺癌細胞4T1作為抗原，alarmins家族成員HMGN1作為佐劑構建乳腺癌瘤苗，進行瘤苗聯合吉西他濱節拍化療的聯合治療，療效顯著且未見明顯毒副反應。

alarmins可通過促進抗原的攝取、處理和呈遞，在獲得性免疫預警過程中發揮關鍵作用［1，5］。HMGN1作為alarmins家族成員之一在修飾瘤苗方面具有其獨特的優勢：可刺激DC增殖、成熟；上調人單核細胞來源的DC表達CD80、CD86、CD83及MHCⅠ/Ⅱ類分子等，并促使其分泌lL-12、IL-6、IL-8、IL-23、TNF等促炎性細胞因子；上調CCL21、CCR7及下調CCL5等參與腫瘤免疫反應，可進一步激活小鼠體內免疫效應細胞［6］。利用腫瘤細胞作為抗原，可避免因腫瘤細胞抗原表位突變而發生的免疫逃逸［7］，提供已知和未知的腫瘤相關抗原，并無需事先鑒定所有抗原分子。本研究發現瘤苗組的體內抗腫瘤效應明顯優于NS組，這可能與HMGN1較強的免疫佐劑效應相關。

腫瘤疫苗臨床療效欠佳的一個重要原因是腫瘤獲得了多種逃逸機體免疫的方法。研究發現Tregs與腫瘤免疫逃逸密切相關［8］，腫瘤微環境中存在的Tregs數量普遍升高，即腫瘤通過某種機制誘導了Tregs的分化，而Tregs可通過多種途徑抑制機體的獲得性和天然性抗腫瘤免疫，介導腫瘤免疫逃逸，促進腫瘤發展［9］。逆轉Tregs的免疫抑制作用將有助于打破腫瘤免疫耐受，提高腫瘤疫苗的療效。研究表明［10］使用小劑量化療藥物循環刺激可顯著降低Tregs數量，小劑量遠低于臨床常用化療劑量，對于多次化療后的晚期乳腺癌患者具有重要意義。常規化療不僅直接殺傷腫瘤細胞，且抑制機體免疫系統，進而削弱腫瘤疫苗的免疫治療效果。在化療聯合免疫治療方面，選擇合適化療藥物劑量［11］和最佳的時間間隔［12］非常重要。近年來，MET研究焦點主要是通過持續作用于腫瘤血管內皮細胞抑制其增殖、遷移，阻斷血管生成，從而達到抑制腫瘤生長的目的。本研究發現MET組及聯合組MVD計數明顯低于瘤苗組或NS組，提示MET顯著抑制血管新生，使腫瘤組織缺血壞死，生長受限，更利于腫瘤疫苗發揮作用，可能是二者協同作用的機制之一。本研究還發現MET組未見明顯毒副反應，表明節拍化療可用于不能耐受常規化療的晚期乳腺癌患者。

隨著研究不斷深入，發現MET可能是一種多靶點的抗癌手段。Jiang等［13］應用紫杉醇MET處理轉移性乳腺癌小鼠模型，除抗血管作用外，還具有抗淋巴管生成的作用，推測MET可能影響腫瘤微環境。Ghiringheli等［14］研究環磷酰胺MET能降低荷瘤小鼠體內的CD4+CD25+Tregs數量，改善T細胞和NK細胞的功能，從而起到免疫增強作用。GEM是核苷酸還原酶抑制劑，通過抑制腫瘤細胞DNA合成發揮抗腫瘤作用，被廣泛用于實體瘤的化療，其不僅直接發揮抗腫瘤活性，還介導與腫瘤免疫治療相關的免疫學效應［10，15］，同時該藥又非常用一線或二線治療藥物，對于晚期乳腺癌患者意義重大。因此，本研究選用GEM節拍化療聯合瘤苗治療，結果顯示聯合組小鼠腫瘤生長較對照組受到顯著抑制，經MET處理的小鼠（MET組及聯合組）腫瘤局部浸潤的Tregs數量明顯少于NS組及瘤苗組（P＜0.05），表明MET可降低腫瘤局部浸潤Tregs數量，進而增強瘤苗療效。

綜上所述，本研究應用HMGN1作為免疫佐劑構建乳腺癌瘤苗有較好的抗瘤療效，MET通過降低腫瘤局部浸潤的Tregs水平，增強瘤苗特異性免疫效應，顯著抑制腫瘤生長，提示在MET后進行瘤苗的主動免疫可誘發較強的腫瘤免疫應答，也為打破腫瘤患者免疫耐受狀態提供了一種新方法。本研究為晚期乳腺癌治療提供了新的選擇，為實體瘤患者的生物-化療模式提供了一新的思路和方法，值得進一步研究。

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（2014-01-16收稿）

（2014-03-26修回）

（本文編輯：張刡）

Anti-tumor effect of tumor vaccine combined with metronomic chemotherapy on breast cancer in mice

Yehui SHI,Liyan ZHOU,Feng WEI,Jinpu YU,Yongsheng JIA,Zhongsheng TONG
Correspondence to:Zhongsheng TONG;E-mail:tonghang@medmail.com

Objective:This study aimed to observe the synergistic effect of a new tumor vaccine combined with metronomic chemotherapy in vivo on breast cancer.This study was also conducted to investigate the mechanism of this combination.Methods:Balb/c mice inoculated with 4T1 mouse breast cancer cell were used as tumor models.High-mobility group nucleosome-binding protein 1 (HMGN1)gene was used to transfect 4T1 cell lines as cancer vaccines.After 4T1 cell was inoculated,the mice were randomized into four groups:normal saline(NS);metronomic gemcitabine(GEM)alone;cancer vaccine alone;and combination therapy group.Tumor growth and potential toxicities of these regimens were observed.The Foxp3 expression of regulatory T cells(Tregs)was detected by western blot and immunohistochemical staining.The microvessel density(MVD)of the tumor was also detected by immunohistochemical staining.Results:The tumor volume of the mice was significantly lower in the combination group than in the MET group or cancer vaccine group(P＜0.05).This result exhibited a higher significant difference than the tumor volume of the mice in the NS group(P＜0.01).Foxp3 expression was significantly lower in the mice treated with GEM(combination or MET group).MVD was significantly lower in these two groups than in the cancer vaccine group or NS group(P＜0.05).Furthermore,adverse reactions slightly occurred in each group.Conclusion:The combination of cancer vaccines and metronomic GEM is a very active and well-tolerated regimen for breast cancer in mice.

cancer vaccine,HMGN1,metronomic chemotherapy,regulatory T cell,Foxp3

10.3969/j.issn.1000-8179.20140125

史業輝 醫學博士，副主任醫師。研究方向為乳腺癌綜合治療。

天津醫科大學腫瘤醫院乳腺腫瘤內科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，乳腺癌防治教育部重點實驗室，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津市腫瘤免疫與生物治療重點實驗室（天津市300060）

*本文課題受天津市科技計劃項目（編號：12ZCDZSY16200），天津市衛生局科技基金（編號：2010KZ76）及天津市高等學?？萍及l展基金計劃項目（編號：20100116）資助

佟仲生 tonghang@medmail.com

E-mail：carfield@medmail.com.cn