白介素7在原發性干燥綜合征患者唇腺組織中的表達及其臨床意義

何春華，張 建，鄒 霓

原發性干燥綜合征(primary Sj?gren′s syndrome，pSS)是一種主要累及外分泌腺體，發病基礎是免疫功能紊亂，T、B淋巴細胞活化增殖，產生大量免疫球蛋白和自身抗體的慢性系統性自身免疫病?？赏瑫r出現腎臟、肺臟、甲狀腺和肝臟等多種器官受累，部分患者可向惡性淋巴瘤發展。人白介素(IL)-7屬于促紅細胞生成素家族Ⅰ型短鏈細胞因子，由152個氨基酸殘基組成，是一種促進淋巴細胞生成的細胞因子。實驗證實IL-7可通過刺激T細胞增殖、分化，維持T細胞存活，誘導單核細胞和B細胞的活化而對淋巴細胞發揮著重要作用[1-2]。目前IL-7在類風濕關節炎[3]、系統性紅斑狼瘡(SLE)[4]發病中的作用已有較多報道。本研究采用免疫組織化學方法檢測pSS患者唇腺組織中IL-7的表達水平，探討IL-7在pSS發病機制中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2005年3月—2012年10月濱州市人民醫院風濕免疫科門診及住院的pSS患者30例為pSS組，均符合2002年干燥綜合征(SS)歐洲分類標準。其中男2例，女28例；年齡34～70歲，平均(44±19)歲；病程4個月～13年。另選擇同時期頜面部創傷和唇腺囊腫患者5例為對照組，其中男1例，女4例；年齡23～53歲，平均(43±17)歲。兩組性別及年齡均具有均衡性。

1.2 主要試劑 兔抗人IL-7單克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)及SP免疫組織化學試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司)。

1.3 免疫組織化學法檢測唇腺組織中IL-7的表達 唇腺石蠟組織切片常規脫蠟，過無水乙醇，3%過氧化氫室溫下作用10 min；水化后，以pH 6.0的1 nmol/L 檸檬酸鈉微波熱修復，加封閉血清后，分別加入4 ℃濕盒過夜，再加入鏈霉卵白素標記的羊抗兔IgG，置濕盒中室溫30 min，而后加入與生物素結合的辣根過氧化物酶，室溫30 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色2 min，自來水沖洗，蘇木素復染，脫水，中性樹膠封片。鏡下觀察胞質有棕黃色顆粒沉著者為陽性。切片在400倍顯微鏡下隨機選擇10個視野(每個視野計數100個細胞)，計算陽性著色細胞數百分比，最后求其均值。表達強度采用半定量方法進行評價，標準為：-(沒有表達)，+(1%～25%)，+ +(26%～50%)，+ + +(50%以上)。

1.4 HE染色法檢測唇腺組織中淋巴細胞浸潤情況 按Chisholm標準進行分級：Ⅰ級：1個淋巴細胞浸潤灶/4 mm2；Ⅱ級：2個淋巴細胞浸潤灶/4 mm2；Ⅲ級：3個淋巴細胞浸潤灶/4 mm2；Ⅳ級：4個及以上淋巴細胞浸潤灶/4 mm2。

1.5 血清指標檢測

1.5.1 采血 抽取pSS患者及對照組靜脈血8 ml，離心分離血清，置-70 ℃冰箱凍存待測。

1.5.2 自身抗體檢測 間接免疫熒光法檢測血清抗核抗體：滴加磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋待檢血清標本為1∶20，吸取20 μl加于Hep-2細胞片上，標本片置于室溫下孵育30 min，玻片置于玻片架上，PBS沖洗2次，各玻片滴加20 μl熒光標記的抗人IgG抗體，將玻片置于室溫下孵育30 min，PBS沖洗，滴加20 μl甘油/PBS，蓋玻片覆蓋，熒光顯微鏡下觀察。結果判斷：熒光顯微鏡下細胞核呈現黃綠色熒光為陽性染色細胞，不發熒光為陰性，抗原片中出現陽性染色細胞為抗核抗體(ANA)陽性，否則為陰性。免疫印跡法檢測抗SSA抗體、抗SSB抗體，操作方法嚴格按產品操作說明書進行。

1.5.3 紅細胞沉降率(ESR)檢測 pSS患者及對照組靜脈血約2 ml，采用魏氏法檢測，將靜脈血與枸櫞酸鈉按4∶1混合，加入魏氏管，記錄ESR。

1.5.4 C反應蛋白(CRP)及免疫球蛋白檢測 pSS患者及對照組靜脈血約2 ml，運用免疫比濁法檢測，將各標本置于全自動特種蛋白分析儀上，按儀器操作說明嚴格進行，記錄CRP、IgG、IgM、IgA結果。

2 結果

2.1 實驗室指標結果 30例pSS患者中26例(87%)ANA為陽性，23例(77%)抗SSA抗體陽性、11例(37%)抗SSB抗體陽性。ESR(39±32)mm/h，CRP(14±11)mg/L，IgG(25±11)g/L，IgM(2.3±1.9)g/L，IgA(3.8±1.6)g/L。

2.2 IL-7免疫組織化學染色結果 IL-7陽性產物定位于胞質，呈棕黃色，主要表達于導管、腺泡上皮細胞及淋巴細胞浸潤灶(見圖1)。pSS組29例呈陽性表達，陽性表達率為97%,對照組1例呈陽性表達，兩組IL-7陽性表達率比較，差異有統計學意義(P=0.013，見表1)。

2.3 HE染色結果 pSS唇腺組織中腺泡小葉及導管周圍灶性淋巴細胞浸潤(1個灶：>50個淋巴細胞/4 mm2)，腺泡破壞，萎縮，導管擴張，纖維結締組織增生，脂肪浸潤(見圖2)。

2.4 IL-7陽性細胞數與淋巴細胞浸潤灶數相關性分析 pSS患者唇腺組織的IL-7陽性細胞數與淋巴細胞浸潤灶數呈正相關(r=0.807，P<0.01，見表2)。

2.5 IL-7陽性細胞數與實驗室指標相關性分析 pSS患者唇腺組織的IL-7陽性細胞數與ESR呈正相關(P<0.01)，與其他實驗室指標無相關性(P>0.05，見表3)。

3 討論

pSS患者唇腺組織破壞的具體機制至今尚未完全闡明，近年研究表明，免疫及炎性相關因素在pSS的發病過程中起了重要作用，而由活化的免疫細胞和一些非免疫細胞經刺激而合成、分泌的炎性相關因子具有極為廣泛的生物學效應，在介導和調節免疫應答及炎性反應方面發揮了重要作用[5]。近期國外研究證實，白介素家族中的IL-7及其受體(IL-7R)在pSS患者唇腺組織及血清中存在高表達，介導了疾病的發生與發展，與pSS關系密切，在SS的發病中起到重要作用，是當前研究較為活躍的領域[6]。

圖1 IL-7高表達于pSS唇腺組織導管上皮細胞、腺泡上皮細胞及淋巴細胞浸潤區(免疫組織化學法，×400)

Figure1 High expression of IL-7 in pSS labial gland tissue ductal epithelial cells,acinar epithelial cells and lymphocytes infiltration area

圖2 pSS患者唇腺組織中淋巴細胞浸潤情況(HE，×400)

Figure2 Lymphocyte infiltration in labial gland tissues in pSS patients with HE staining

表1 兩組IL-7表達情況(例)

表2 IL-7陽性細胞數與淋巴細胞浸潤灶數相關性分析結果(例)

Table2 Relationship between lymphocytic infiltration focus and the the positive cells of IL-7

淋巴細胞浸潤灶數例數IL-7 - + ++ +++Ⅰ級21100Ⅱ級30300Ⅲ級100262Ⅳ級1500312

表3 IL-7陽性細胞數與實驗室指標相關性分析結果

Table3 Analysis of the correlation between the positive cells of IL-7 and laboratory indexes

ESRCRPIgGIgMIgAr值 05460217032101390191P值<0010259005603430317

注：ESR=紅細胞沉降率，CRP=C反應蛋白

IL-7是Namen等在1988年發現的主要由胸腺和骨髓基質細胞分泌的相對分子質量為25 000～28 000的糖蛋白，其由152個氨基酸殘基組成，編碼基因位于8q12-13，包含6個外顯子和5個內含子。研究發現，IL-7通過誘導T細胞相關受體的表達而介導了Th1和Th17細胞的分化，從而增加了IL-2、IL-17、IL-22等相關細胞因子的分泌，而這幾種細胞因子又是導致SS發病的重要炎性因子,阻斷IL-7R能明顯降低Th1和Th17細胞的活性，從而降低相關炎性因子的表達[7]。Katsifis等[8]采用免疫組織化學、實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)等方法對確診pSS患者及對照組人群進行比較后證實：pSS患者涎腺組織中IL-17及相關因子的表達與炎性反應的程度及臨床表現相關。Gonzalez-Quintial等[9]發現，在SLE小鼠模型中，隨著成纖維網狀細胞的增殖IL-7表達亦增加，并促進自身反應性T細胞增殖及自身免疫性疾病的進展，即使是在疾病的進展期，應用IL-7R拮抗劑仍可抑制自身反應性T細胞活性并遏制疾病發展。這表明調節IL-7的平衡或許可成為一種治療或緩解自身免疫性疾病的方法。IL-7R+T細胞參與了SS患者唇腺組織增強的炎性反應，尤其與IL-7的表達增高有關[10]。Nguyen等[11]在非易患SS的C57BL/6J小鼠(6～8周齡和15～17周齡)涎腺組織中注入表達IL-17A的血清5型腺病毒載體，制成SS樣的動物模型，最終發現了淋巴細胞的浸潤、細胞因子水平升高及涎液流量降低等改變，進而表明IL-17A是涎腺功能受損的重要炎性因子,抗IL-17的靶向治療可能對改善腺體功能有效[12]。IL-7Rα抗體通過抑制IL-7R功能阻斷了IL-7/IL-7R/Th17之間的信號傳導，減少了相關炎性細胞因子的產生，從而阻斷了炎性反應過程，因此通過改變調節IL-17細胞增殖分化的上位細胞因子IL-7/IL-7R可能為治療SS及其他自身免疫性疾病提供有效的新思路。Quartuccio等[13]研究證實人B淋巴細胞刺激因子(BlyS)與SS患者的免疫學指標、B細胞病理性克隆、疾病活動度及B細胞淋巴瘤關系密切，指出BlyS在SS發病中具有重要作用。在風濕性疾病的炎性組織中，巨噬細胞、樹突細胞(DC)和成纖維細胞均可分泌IL-7，伴隨IL-7高表達的有T細胞分化刺激因子、炎性趨化因子、黏附因子等及異位淋巴樣聚集體形成，提示IL-7是重要的促炎性遞質。IL-7既可通過自身對T、B淋巴細胞作用的調節發揮其在SS中的重要作用，還可通過誘導其他細胞因子來調節其效應，以上研究結果都顯示炎性相關因子在風濕性疾病中的重要作用[14]。故以IL-7/IL-7R為治療靶點在風濕性疾病的治療中具有重要意義。

本研究采用免疫組織化學法檢測了IL-7在pSS患者及對照者唇腺組織中的表達，并分析了其與唇腺組織中淋巴細胞浸潤及其他實驗室指標的關系。結果顯示，pSS患者唇腺組織中有IL-7高表達及大量的淋巴細胞浸潤，而對照組低表達，并且IL-7陽性細胞數與淋巴細胞浸潤灶數呈正相關，表明唇腺組織有無淋巴細胞浸潤影響IL-7是否表達及表達量，而表達的IL-7反過來也對浸潤的淋巴細胞的發育、增殖起到重要的作用，證實IL-7參與了pSS炎癥損傷的過程。同時也發現了IL-7在pSS唇腺組織表達的特點，即IL-7高表達于導管、腺泡上皮細胞及淋巴細胞浸潤區，且呈胞質表達，提示其與導管上皮細胞、腺泡細胞及浸潤的淋巴細胞關系密切，在pSS發病中發揮重要作用，與已知的IL-7可通過刺激T細胞增殖、分化，維持T細胞存活，誘導單核細胞和B細胞的活化而對淋巴細胞發揮重要作用的功效相吻合。

ESR是反映體內炎癥活動的指標之一，本研究證實IL-7陽性細胞數與ESR呈正相關，提示IL-7的表達水平與pSS的急性炎癥密切相關。但是本研究未發現與pSS活動程度密切相關的其他實驗室指標如血清免疫球蛋白水平的關系，可能與兩者所介導的炎癥不同階段有關，可在今后的研究中進一步證實。

唇腺組織中淋巴細胞的聚集通常作為pSS診斷的一個重要組織學指標，但由于取材、染色等各因素及在實際操作中存在靈敏度或特異度不夠強的缺點，可能影響診斷結果。

總之，本研究結果提示IL-7在pSS的發病中起到重要的作用，但由于實驗條件所限，本研究未涉及pSS患者血清組織內IL-7表達情況，因此進一步明確其在血清內的表達情況，可能會為進一步探討其在pSS具體作用機制以及與其他免疫細胞的相互作用提供實驗基礎，有可能對早期阻止病情進展，為治療該類疾病提供新的思路。另外，pSS唇腺組織檢測到IL-7的高表達,為以后將唇腺組織的IL-7檢測作為SS的一個輔助診斷手段提供了初步的實驗基礎。

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