循環腫瘤細胞預測肝細胞癌患者臨床預后價值的Meta分析

曹宇勃，許崇安

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，發病率居全球惡性腫瘤第6位，病死率高居第3位[1-2]。我國是乙型肝炎大國，約有3 000萬慢性病毒性肝炎患者，而慢性病毒性肝炎可逐漸演變為肝硬化，其中90%左右的肝硬化患者晚期可合并肝癌，我國已成為全世界肝癌高發地區之一[3-5]。與肝癌發生相關的主要危險因素有酗酒、黃曲霉素攝入、乙型肝炎病毒(HBV)感染和丙型肝炎病毒(HCV)感染等[6-7]。隨著人類基因組學對肝臟腫瘤分子機制研究的不斷深入，人們已經意識到肝癌的發生與發展是個極其復雜的病理生理過程，與多種基因突變及其表觀遺傳學改變有關[8-9]。

循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)指脫離了原發病灶，侵襲并進入血液循環的癌細胞，也稱之為“播撒腫瘤細胞”(disseminated tumor cells，DTCs)。早在1869年，澳大利亞學者Ashworth就發現死于轉移癌患者的血液中存在一種與原發腫瘤細胞相似的細胞，由此首次提出了CTCs的概念[9-10]。相關研究證實，CTCs的存在可能是惡性腫瘤在遠處形成轉移性病灶的中間過程，與患者的臨床預后有著密切關系[11]。近年來，敏感分子技術的發展使分離和計數外周血中的CTCs成為可能。在疾病早期階段，CTCs有助于良、惡性腫瘤的鑒別，轉移風險的預測和判斷；在疾病進展期，CTCs能提供重要的預后信息，有助于醫生監測治療效果。此外，CTCs能反映腫瘤特征，指導治療方案的制定，故可以作為靶向治療的靶標[12]。大量研究表明，外周血CTCs是預測HCC患者預后的可靠生物學指標，可在治療過程中及時有效地監測HCC患者臨床治療效果并可隨時預測疾病進展情況和患者預后生存期[12-13]。然而，也有部分研究認為外周血CTCs對于預測HCC患者預后臨床意義不大[14]。鑒于既往研究的爭議性結果，本Meta分析通過全面收集相關研究來評價外周血CTCs預測HCC患者臨床預后的真實價值，以期為HCC的臨床診斷和治療提供參考依據和幫助。

1 資料與方法

1.1 資料檢索 計算機檢索PubMed、EMBase、Web of Science、Cochrane Library、CISCOM、CINAHL、Google學術、中國生物醫學文獻數據庫(CBM)和中國知網等中英文數據庫，手工檢索相關參考文獻，檢索時間從其建庫至2013-08-01，文獻檢索策略采用主題詞和自由詞結合的原則，檢索詞主要包括：循環腫瘤細胞、circulating tumor cells、embolic tumor cells、disseminated tumor cells、肝癌、hepatocellular carcinoma、HCC、prognosis、預后、survival、生存期等。手工檢索納入文獻的參考文獻以發現潛在符合納入標準的研究。

1.2 納入與排除標準 文獻納入標準：(1)外周血CTCs預測HCC患者預后的臨床研究。(2)患者均經病理組織學證實為HCC；(3)納入文獻均提供完整的HCC患者預后的數據資料如總生存期(OS)、無復發生存期(RFS)、無病生存期(DFS)等；(4)語言均為中文或英文。不符合上述納入標準的文獻將被剔除。同一作者采用相同病例進行了多項研究并發表，則僅納入樣本量最大的研究或者最近發表的研究。

1.3 數據提取 采用統一制定的數據收集表，由兩位研究者分別獨立提取納入文獻數據資料，主要數據信息包括：第一作者、發表時間、國家、種族、診斷、性別、檢測方法、CTCs表達情況、結局指標。如存在爭議，通過與第三方討論解決分歧。

1.4 納入文獻質量評分 由兩位研究者根據NOS(Newcastle-Ottawa Scale)分別對納入文獻的質量進行評價[15]。NOS滿分為 9 分，包括觀察組和對照組研究對象的定義和選擇、兩組的可比性、暴露因素3方面內容?！?分為高質量。

1.5 統計學方法 采用STATA 12.0(Stata Corp，College Station，TX，USA)軟件進行。采用固定效應模型或隨機效應模型計算危險比(HR)及其95%可信區間(95%CI)評價CTCs陽性和CTCs陰性HCC患者預后差異，并對合并效應值進行Z檢驗。各研究間異質性采用CochranQ檢驗進行評價，若P<0.05則提示異質性差異有統計學意義[16]；此外，采用I2檢驗定量評價異質性大小，I2值介于0%～100%[17]，I2值越大提示異質性越明顯；如異質性檢驗P<0.05或I2>50%則提示各研究間存在異質性，故采用隨機效應模型(DerSimonian Laird法)分析，反之則采用固定效應模型(Mantel-Haenszel法)分析。根據種族、臨床診斷和檢測方法進行了亞組分析以探究各組間異質性來源，并逐一刪除納入研究進行敏感性分析以評價單一研究對總體結果的影響。采用Begger漏斗圖和Egger線性回歸分析納入文獻是否存在發表偏移以評價原始分析結果的真實可靠性[18]。

2 結果

2.1 納入研究的基線特征 最初檢索到相關文獻385篇，根據其題目和關鍵詞剔除208篇，進一步閱讀摘要和全文后剔除165篇，最終12項隊列研究符合納入標準進入本Meta分析[19-30]。納入研究的發表時間1997—2013年。文獻納入篩選流程見圖1。過去十年電子數據庫中與主題相關的文獻數量的分布見圖2。納入的12項研究包括1 133例HCC患者，其中CTCs陽性患者559例和CTCs陰性患者574例。8項來自于歐美人群，其余4項來自于亞洲人群。8項采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)法檢測外周血CTCs表達情況，其余4項采用CellSearch法進行檢測。12項納入文獻總體質量較高，除1項研究質量評分為5分之外，其余研究質量評價均≥6分。納入研究的基線特征和質量評價見表1。

2.2 Meta分析結果 各研究間存在異質性(均I2>50%，P<0.05)，故采用隨機效應模型分析。Meta分析結果顯示：CTCs陽性HCC患者的OS和RFS短于CTCs陰性患者，差異有統計學意義〔OS：HR=1.53，95%CI(0.98，2.07)，P<0.001；RFS：HR=3.14，95%CI(0.70，5.58)，P=0.012〕。CTCs陽性患者與CTCs陰性患者的DFS差異無統計學意義〔HR=1.35，95%CI(-0.75，3.46)，P=0.207,見圖3〕。

根據種族不同進行亞組分析發現，歐美人群和亞洲人群CTCs陽性患者OS與RFS均短于CTCs陰性患者，差異有統計學意義〔歐美人群：HR=2.09，95%CI(1.29，2.89)，P<0.001；亞洲人群：HR=1.14，95%CI(0.65，1.64)，P<0.001,見圖4〕。

根據臨床診斷不同進行亞組分析顯示，CTCs陽性的原發性和繼發性HCC患者OS與RFS均短于CTCs陰性患者，差異有統計學意義〔原發性HCC：HR=1.14，95%CI(0.70，1.57)，P<0.001；繼發性HCC：HR=2.54，95%CI(1.54，3.55)，P<0.001，見圖5〕。

根據不同檢測方法進行亞組分析發現，在qRT-PCR 和CellSearch 亞組中CTCs陽性患者OS與RFS均短于CTCs陰性患者，差異有統計學意義〔qRT-PCR：HR=1.36，95%CI(0.87，1.86)，P<0.001；CellSearch：HR=2.57，95%CI(1.19，3.94)，P<0.001，見圖6〕。

圖1 文獻篩選流程圖

圖2 外周血CTCs預測HCC患者臨床預后相關文獻的年限分布圖

Figure2 Distribution of the number of years of topic-related literatures in the electronic database

注：RFS=無復發生存期,OS=總生存期,DFS=無病生存期

圖3 CTCs陽性與CTCs陰性HCC患者的RFS、OS、DFS比較

Figure3 Comparison of RFS,OS and DFS between the CTCs-positive and CTCs-negative HCC patients

2.3 敏感性分析與發表偏移 采用單因素及多因素回歸分析探討異質性來源，結果表明任何因素均不是異質性的主要來源(均P>0.05,見表2)。逐一刪除納入研究進行敏感性分析以評價單一研究對總體結果的影響，結果表明無單一研究可顯著影響原始分析和亞組分析結果的差異(見圖7)。Begger漏斗圖圖形對稱，提示無明確發表偏移(見圖8)。Egger線性回歸分析進一步證實納入文獻無發表偏移(t=-0.68，P=0.513)。

3 討論

CTCs是自發或因診療操作由實體瘤或轉移灶釋放進入外周血循環的腫瘤細胞[31]。大部分腫瘤細胞進入循環系統后被免疫系統識別并清除，但是少量腫瘤細胞會獲得新的特征而在血液中存活，這些細胞即是CTCs；未被清除的CTCs通過遷移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，并在一定條件下發展為轉移灶[32]。既往研究表明，外周血中CTCs的含量與惡性腫瘤的治療效果和預后有密切的關系。HCC是世界上最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年有564 000例新發病例，其5年生存率不足5%[33-35]。因此，尋找方便、快速、準確的生物標志物以早期診斷HCC、預測HCC患者臨床治療療效及預后已成為近年來的研究熱點[36]。最新研究表明，外周血CTCs可作為HCC療效評估指標及加強輔助化療的選擇性指標，有助于建立個體化治療方案，從而降低HCC復發率，延長患者生存期，使HCC的綜合治療更加及時、完善、有效[37]，但該觀點尚存在爭議。

表1 納入文獻基線特征與質量評分

注：CTCs=循環腫瘤細胞，HCC=肝細胞癌，qRT-PCR=實時熒光定量聚合酶鏈反應,RFS=無復發生存期,OS=總生存期,DFS=無病生存期

表2 異質性來源單因素及多因素回歸分析結果

Table2 Univariate and multivariate regression analyses of potential source of heterogeneity

因素偏回歸系數標準誤Z值P值95%CI年限 單因素-01670096-1740083(-0356，0022) 多因素-01640122-1350178(-0403，0075)國家 單因素003603570100919(-0663，0736) 多因素160310291560120(-0415，3620)種族 單因素045710110450652(-1525，2438) 多因素-15690769-1220072(-1917，1222)診斷 單因素071109380760448(-1128，2550) 多因素178414021410160(-0075，3493)檢測方法 單因素151108061870061(-0070，3091) 多因素197509522050058(-0129，3820)生存期 單因素016106130260793(-1041，1362) 多因素-05870469-1250210(-1506，0332)

圖4 不同種族CTCs陽性與CTCs陰性患者預后比較

Figure4 Comparison of prognosis between CTCs-positive and CTCs-negative HCC patients of different ethnicity

圖5 不同臨床診斷CTCs陽性與CTCs陰性患者預后比較

Figure5 Comparison of prognosis between CTCs-positive and CTCs-negative patients with primary and metastatic HCC

圖6 不同檢測方法CTCs陽性與CTCs陰性患者預后比較

Figure6 Comparison of prognosis between CTCs-positive and CTCs-negative HCC patients with different detection method

圖7 單一研究對總體結果影響的敏感性分析結果

Figure7 Sensitivity analysis of the influence of each individual study on the pooled HRs by omitting individual studies

圖8 評價發表偏移的Begger倒漏斗圖

Figure8 Begger′s funnel plots of the potential publication bias of included studies

本Meta分析評價外周血CTCs預測HCC患者預后，共計12項隊列研究被納入，Meta分析結果顯示，外周血CTCs陽性患者的OS與RFS低于CTCs陰性患者，提示外周血CTCs可能與HCC患者臨床預后有著密切關系。眾所周知，CTCs可在血液中形成微小癌栓，并在一定條件下發展為轉移病灶，加快腫瘤的進展。已有研究表明，部分肝癌患者肝癌切除或肝移植前，已有腫瘤細胞脫落進入血循環系統中，從而導致肝癌血行轉移[6]。雖然HCC的具體發病機制尚不明確，但已有研究表明外周循環血中CTCs的檢測及評估可以指導HCC治療、預測預后、判斷治療效果、監測腫瘤的轉移或復發，是一種具有高度可行性的、信息含量高的新型診斷手段[38]。亞組分析結果表明，亞洲人群和歐美人群CTCs陽性患者預后均差于CTCs陰性患者，提示CTCs預測HCC患者預后無明顯種族差異，適合各種人群HCC患者的療效預測及預后判定。以上結果與既往研究結果基本一致，提示CTCs可作為預測HCC患者預后重要的生物學指標。

然而本研究也存在一定的局限性：首先，納入文獻過少可能影響本Meta分析結果的統計效能，故仍需大樣本量進一步證實。其次，作為回顧性研究，Meta分析可能存在選擇性偏移，從而影響研究結果的可信度。再次，由于無法獲取納入研究的原始數據，因而限制了CTCs檢測對HCC患者預后價值的深入探討。盡管納入研究均有明確的納入標準，但仍存在未考慮到的潛在因素影響分析結果。因此，需進一步擴大樣本量來探討CTCs對HCC患者預后的預測價值。

綜上所述，現有證據表明：CTCs陽性HCC患者的OS和RFS均劣于CTCs陰性患者。檢測外周血中CTCs對判斷HCC的臨床預后具有重要意義。本研究結論初步闡釋了外周血CTCs表達情況與HCC臨床預后的關系，為深入了解HCC疾病進展的具體機制提供了線索；同時，也為HCC的早期診斷、治療指導及預后判斷提供了理論依據。

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