小干擾RNA對椎間盤炎癥大鼠神經生長因子的影響研究

王 剛

椎間盤源性腰痛(discogenic low back pain，DLBP)為現代骨科醫學的研究難點和熱點，其病因復雜，發病機制尚未明確，臨床上缺乏特異的治療方法[1]。流行病學調查結果顯示，隨著人們現代社會生活節奏的加快和工作強度的提升，DLBP發病率呈逐年上升趨勢[2-3]。電生理學研究表明，機體在正常生理狀態下，神經纖維僅存在于椎間盤纖維環外層，而DLBP患者的纖維環內層乃至髓核內部均可見神經纖維分布，提示神經纖維長入可能為DLBP的重要發病機制[4-5]，為其臨床治療方向由宏觀行為學向分子生物學轉變提供了新的理論支撐。神經生長因子(nerve growth factor，NGF)過表達和炎性因子過分泌是DLBP發病機制中的研究熱點[6-7]。本研究以椎間盤炎癥大鼠為動物模型，旨在探討小干擾RNA(siRNA)對NGF的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，雌雄各半；體質量180～240 g，平均(223.0±12.4)g；月齡2.5～3.5個月，平均(2.9±0.7)個月；購于中山大學醫學院動物中心，批號：SYXK(粵)2007-0081。

1.2 主要儀器與試劑 主要儀器：PCR儀(C1000 Thermal cycler，BIO-RAD)，熒光定量儀(IQ5，BIO-RAD)，制冰機(AF100，Scotsman)，低溫超速離心機(Scanspeed 1730，Labogene)，微型振蕩器(QL-901，海門市麒麟醫用儀器廠)，流式細胞儀(EPICS? ALTRATM，Beckman)等。主要試劑：LipofectamineTM2000(Inbitrogen)，Trizol總RNA提取試劑盒(Inbitrogen)，NGF酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定試劑盒(Chemicon)，Oligo dT Primer、Random Primer、5×PrimeScriptTMBuffer等PCR試劑均由TAKARA公司提供；其他試劑如乙醇、氯仿等為國產分析純；IL-6、IL-1β試劑盒購于Peprotechec公司；DMEM/F12培養基和胎牛血清購于Gibco公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞體外培養 細胞體外培養方法參照參考文獻[8]。(1)手術分離60只大鼠椎間盤髓核及纖維環細胞：取出椎間盤組織后立即用冰磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，分離髓核組織并在DMEM/F12培養基中剪碎，離心半徑15 cm，4 000 r/min，4 ℃離心5 min后重懸，37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養 8 h；離心半徑15 cm，4 000 r/min，4 ℃離心5 min去上清液，PBS漂洗后，依次用0.25%胰蛋白酶、2%Ⅱ型膠原酶消化，離心半徑15 cm，4 000 r/min，4 ℃離心5 min去上清液；再用DMEM/F12重懸，細胞計數板計數，確定細胞數可達104/L以上，并調整細胞計數為1×104/L，轉移到37 ℃、5%CO2培養箱中培養。(2)細胞培養 7 d后，以無血清培養基培養24 h。將大鼠分為對照組(n=12)和實驗組(n=48)，對照組在含0.3%胎牛血清的DMEM/F12培養基中繼續培養，實驗組中分別加入10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L的IL-6、IL-1β培養48 h，每個亞組12只。

1.3.2 NGF-siRNA的導入和鑒定 選擇對數生長期細胞并調整細胞數為2.5×106/ml；根據說明書，將焦碳酸二乙酯(DEPC) H2O和LipofectamineTM2000按比例稀釋后與NGF-siRNA混勻，孵育10 min，等比例(2.5×105/孔)加入6孔板中，輕搖混勻；37 ℃、5%CO2培養箱孵育，及時換液。導入NGF-siRNA前后以流式細胞儀測定細胞轉化率，計算NGF-siRNA細胞轉化率。

1.3.3 NGF mRNA相對表達量的測定 NGF mRNA的實時Q-PCR引物序列：上游引物為5′-ACTTCAGCATTCCCTTGACACA-3′，下游引物為5′-ACGGGCAGCTATTGGTTCAG-3′，Probe為5′-FAM-CCCTCCGCAGAGCCCGCA-TAMRA-3′；以GAPDH為內參基因，引物序列：上游引物為5′-AGGGCTGCCTTCTCTTGTGA-3′，下游引物為5′-AACTTGCCGTGGGTAGAGTCA-3′，Probe為5′-FAM-CCATCAACGACCCCTTCATTGACCTC-TAMRA-3′。逆轉錄和PCR擴增均由PCR儀自動完成，采用常規體系進行配比，反應條件：逆轉錄：7 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；擴增：93 ℃ 2 min；93 ℃ 15 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，共40個循環；72 ℃ 10 min。

Ct值(拷貝數/μl cDNA)為熒光信號達到設定域值所經歷的循環數，每個模板的Ct值與該模板起始拷貝數的對數存在線性關系，即起始拷貝數越多，Ct值越小?？紤]到各樣本總RNA濃度的差異，NGF mRNA相對表達量=Ct目的基因/Ct內參基因。

1.3.4 NGF細胞液濃度的測定 收集細胞培養液100 μl，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作測定細胞液NGF濃度。

2 結果

2.1 細胞鑒定 (1)甲苯胺藍染色結果顯示，髓核細胞染色呈強陽性(見圖1A)；纖維環細胞染色胞核為紫色，胞質為深藍色，細胞多呈梭形，胞質內可見較多空泡(見圖1B)。(2)番紅O染色結果顯示，髓核細胞染色呈陽性，胞質為粉紅色，核周可見棕紅色顆粒狀物質(見圖2A)；纖維環細胞著色較淺(見圖2B)。細胞體外培養成功，順利取得椎間盤髓核細胞及纖維環細胞。

注：A為髓核細胞，B為纖維環細胞

圖1 大鼠椎間盤髓核細胞及纖維環細胞染色結果(甲苯胺藍染色，×200)

Figure1 Dyeing appraisal results of intervertebral disc nucleus pulposus cells and annulus fibrosus cells of rats

注：A為髓核細胞，B為纖維環細胞

圖2 大鼠椎間盤髓核細胞及纖維環細胞染色結果(番紅O染色，×200)

Figure2 Dyeing appraisal results of intervertebral disc nucleus pulposus cells and annulus fibrosus cells of rats

2.2 細胞轉化率 流式細胞儀檢測結果顯示，NGF-siRNA細胞轉化率為99.8%(見圖3)。

2.3 NGF mRNA相對表達量 GAPDH和NFG mRNA標準擴增曲線平行性良好，曲面光滑，擴增條件準確、特異度高(見圖4A、4B)；GAPDH和NFG mRNA標準直線回歸圖顯示兩者回歸性良好，回歸系數R2均>0.99，具有較高重現性(見圖4C、4D)。導入NGF-siRNA前，10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L組NGF mRNA相對表達量均較對照組上調，分別上調3.4、3.7、4.7、8.0倍(P<0.05)；導入NGF-siRNA后，各組NGF mRNA相對表達量均較導入前下調，分別下調39.5%、45.5%、45.3%、39.9%、47.8%(P<0.05，見圖4E、4F，表1)。

2.4 細胞液NGF濃度 導入NGF-siRNA前，10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L組細胞液NGF濃度均較對照組升高，分別升高2.9、3.3、4.5、7.4倍(P<0.05)；導入NGF-siRNA后，各組細胞液NGF濃度均較導入前降低，分別降低47.2%、33.8%、35.4%、43.0%、54.9%(P<0.05，見表2)。

注：A為導入NGF-siRNA前，B為導入NGF-siRNA后

圖3 導入NGF-siRNA前后流式細胞儀檢測結果

Figure3 Flow cytometry results of cultured cells before and after NGF-siRNA interference

Table1 Comparison of NGF mRNA expression before and after NGF-siRNA interference

時間對照組10nmol/L組20nmol/L組50nmol/L組100nmol/L組F值P值導入前0114±00210388±0032?0422±0037?0536±0041?0912±0064?77140000導入后0069±00140224±0017?0231±0024?0322±0031?0476±0039?41210007差值0045±00130164±0016 0191±0021 0214±0027 0436±0041 t值26442214238423192654P值00120023001700180011

注：與對照組比較，*P<0.05

Table2 Comparison of NGF levels before and after NGF-siRNA interference

時間對照組10nmol/L組20nmol/L組50nmol/L組100nmol/L組F值P值導入前214±236621±113?706±147?963±214?1580±334?11240000導入后113±203411±213?456±227?549±247? 713±316? 67740000差值101±194210±162 251±164 414±173 867±334 t值24532382231525142653P值00140017001900130011

注：與對照組比較，*P<0.05

注：A和B分別為GAPDH和NFG mRNA標準擴增曲線；C和D分別為GAPDH和NFG mRNA標準直線回歸圖；E和F分別為GAPDH和NFG mRNA樣本擴增曲線

圖4 GAPDH和NFG mRNA的Q-PCR結果

Figure4 Q-PCR assay results of GAPDH and NFG mRNA

3 討論

DLBP又稱椎間盤內紊亂，為漸進性退變，病變部位不僅局限于發病椎體自身，且隨著病情進展，鄰近節段均可出現受累，最終可累及整個椎骨體系[9-10]。從形態病理學而言，DLBP患者多存在椎間盤纖維環和髓核裂隙、破損及骨密度降低，導致患者脊柱生理曲度異常，運動節段機械力學失穩和神經機械性損傷；從神經病理學而言，DLBP患者神經纖維分布密度增加，疼痛感受器閾值較低，存在廣泛的痛敏反應；從生物病理學而言，DLBP患者的機械損傷和痛敏反應以炎性反應為媒介，相輔相成，互為因果。

既往研究表明，椎間盤損傷過程中涉及腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-1β、IL-6等大量炎性遞質的介導和參與，且其椎間濃度變化在發病急性期表現最為突出[11-12]，提示炎性遞質為DLBP病情加重的重要誘因，但其具體機制尚未完全明確。本研究以炎性椎間盤細胞為靶細胞，進行IL-1β及IL-6干預實驗；結果顯示，10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L組NGF mRNA相對表達量均較對照組上調，細胞液NGF濃度均較對照組升高，且NGF mRNA相對表達量上調幅度及細胞液NGF濃度升高幅度與IL-1β及IL-6呈劑量依賴性，即隨著IL-1β及IL-6濃度增加，NGF mRNA相對表達量上調幅度及細胞液NGF濃度升高幅度增大，提示炎性因子IL-1β及IL-6的分泌為誘導大鼠椎間盤NGF表達的重要誘因。

NGF為自體神經元營養供給的基礎成分之一，可參與神經元的生長、發育、修復、再生等多項基本生理功能，在大鼠胚胎椎間盤中分部廣泛，用以維持脊髓神經細胞分化和增殖[13]；而在健康成鼠中，NGF多見于椎間盤纖維環外緣，髓核濃度甚微。NGF異常高表達可能與受損神經細胞的自我修復過程的啟動密切相關，為近年骨與神經外科損傷的研究熱點[14]。Fire等[15]研究認為，NGF異常高表達為DLBP神經長入的主要微觀病理機制，且DLBP炎性疼痛的信號傳導以NGF依賴性神經元為主要媒介，提示NGF不僅誘導了DLBP的神經長入，還參與了其炎性疼痛的致敏效應。推測炎性遞質IL-1β及IL-6誘導的NGF異常高表達為椎間盤損傷的重要機制之一。因此，本研究以siRNA干擾技術對IL-1β及IL-6誘導的NGF異常高表達進行抑制，結果顯示，導入NGF-siRNA后，各組NGF mRNA相對表達量及細胞液NGF濃度均較導入前下調及降低，提示NGF-siRNA能夠抑制炎性因子IL-6及IL-1β對椎間盤細胞NGF的誘導效應，為DLBP的治療提供了新靶點。

總之，本研究在體外細胞水平證實了炎性因子IL-6及IL-1β誘導DLBP的可能機制，為NGF-siRNA治療DLBP的可行性提供了重要的實驗數據。但本研究以大鼠椎間盤體外培養細胞為載體，也存在一定的局限性：(1)大鼠模型制備采用的是弗氏佐劑，其基本原理為直接刺激結核桿菌致關節炎抗原，即65 kD的熱休克蛋白(HSP)，進而激發炎性反應，其致炎時限一般為10～20 d，20 d可達高峰，而真正的DLBP發病機制復雜，多數患者屬長期、慢性病變，因此，弗氏佐劑制備的椎間盤炎性模型僅能夠模擬DLBP的部分炎性反應，在模型制備上，尚需完善和改進；(2)本研究為體外動物實驗，雖證實NGF-siRNA干擾治療DLBP有一定作用，但尚需進行更多的體內試驗進一步驗證療效，這也是下一步研究的重點。

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