黃鯽線粒體DNA控制區結構及長度多態性分析

蔡珊珊徐勝勇宋 娜高天翔張朝暉

(1. 中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所, 青島 266003; 2. 國家海洋局第一海洋研究所, 青島 266061)

黃鯽線粒體DNA控制區結構及長度多態性分析

蔡珊珊1徐勝勇1宋 娜1高天翔1張朝暉2

(1. 中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所, 青島 266003; 2. 國家海洋局第一海洋研究所, 青島 266061)

魚類線粒體DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)因為具有結構簡單、嚴格的母系遺傳、缺少重組等特點而成為重要的分子標記[1—4]。線粒體DNA控制區(Control region, CR, 又稱D-loop區)是一段非編碼區, 進化速率快, 容易積累較多的變異(如堿基的替換、插入和缺失等), 被廣泛應用于種內分子遺傳學研究[5—7]?？刂茀^一般分為終止序列區、中央保守區和保守序列區3部分?？刂茀^變異多發生于終止序列區, 中央保守區和保守序列區相對保守,且存在多個保守片段(CSB-F、CSB-E、CSB-D、CSB-1、CSB-2、CSB-3等)[7]。目前已分析研究了多種魚類的線粒體DNA控制區結構[7—15], 并總結歸納出控制區各保守片段的普遍形式[7]。在部分魚類線粒體DNA控制區中亦發現長度多態性現象[7,14,15], 控制區長度多態性可能應用于種內或種間群體學研究[16]。

黃鯽(Setipinna tenuifilis)隸屬鯡形目(Clupeiformes)、鳀科(Engraulididae)、黃鯽屬, 廣泛分布于印度洋西部和西北太平洋海域, 中國沿海各海域均有分布。黃鯽為近海中下層魚類, 喜棲息于泥沙底、水流較緩的海區[17,18]。黃鯽是一種小型經濟魚類。20世紀80年代以來, 隨著小黃魚、藍點馬鮫、帶魚等傳統經濟魚類資源量下降, 黃鯽的捕獲量逐年增加[18]。由于捕撈壓力過大, 黃鯽資源量已呈現下降趨勢[19—21]。目前對黃鯽的研究主要集中在時空分布、種群結構和生物學等方面[18—22]。Li等[23]和張博[24]對黃鯽控制區序列進行分析研究, 識別了CSB-F、CSB-E、CSB-D、CSB-1、CSB-2、CSB-3, 并在終止序列區內發現重復序列現象。本研究在分析黃鯽線粒體DNA控制區結構的基礎上, 對控制區長度多態性進行統計分析, 以期為黃鯽群體遺傳學研究奠定基礎, 同時探討重復序列應用于黃鯽群體遺傳學分析的有效性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用黃鯽樣品于2005—2013年采自中國沿海7個地點(東營、煙臺、青島、南通、溫州、廈門、北部灣), 共202尾個體(表1)。在實驗樣品經形態學鑒定后, 取小塊肌肉組織于 95%酒精溶液中固定, 置于–20℃冰箱中保存待用。

1.2 DNA提取及PCR擴增

取肌肉組織約100 mg經蛋白酶K消化后, 使用標準酚-氯仿法抽提獲得線粒體基因組DNA。使用100 mL去離子水溶解線粒體基因組 DNA, 置于–4℃冰箱中保存待用。每個群體取5尾個體擴增控制區全序列用于控制區結構分析, 其他個體僅擴增控制區高變區(Hypervariable region I)用于長度多態性分析。

表1 黃鯽樣品信息Tab. 1 Sample information of Setipinna tenuifilis

黃鯽控制區全序列擴增分兩段測序, 其中控制區高變區引物[25]為: HJF: 5′-CACCCYTRRCTCCCAAAGCYA-3′; HJR: 5′-GGAACACCGAGTAATGCTGAG-3′; 控制區后半段引物為: HJHF: 5′-CATTTTCTATGCGTTCCTCAG-3′; HJHR: 5′-GTGCGGATACTTGCATGTGT-3′。

PCR反應體系為25 μL, 其中Taq酶0.25 μL, DNA模板1 μL, 正、反向引物各1 μL, dNTP 2 μL, 10×PCR buffer 2.5 μL, 去離子水17.25 μL。PCR反應條件為94℃預變性5min; 94℃變性45s, 52℃退火45s, 72℃延伸45s, 共35個循環; 72℃延伸10min。取2 μL PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳(U = 300 V), 使用回收試劑盒(上海沃森生物科技公司)對目的條帶進行回收純化, 使用 ABI Prism 3730型DNA序列分析儀對回收純化的PCR產物進行正反鏈測序。

1.3 數據分析

使用 DNASTAR軟件包(DNASTAR, Inc., Madison, USA)對序列進行比對、編輯和分析, 并對結果輔以人工校正; 使用Microsoft Excel 2010軟件對重復序列頻率進行統計分析; 使用RNAstructure 4.3軟件[26]分析重復序列二級結構并計算其釋放的自由能; 使用SPSS 18.0軟件對重復序列頻率進行卡方檢驗(Chi-square test), 以計算兩兩群體間重復序列頻率的差異顯著性。

按照Birky等[27]的理論, 計算不同層次遺傳多樣性。由于黃鯽控制區DNA不存在個體內異質性現象, 個體內遺傳多樣性 Kb= 0; 群體內個體間遺傳多樣性 Kc= 1–ΣXi2, Xi指某一DNA類型(長度差異)在群體內的頻率; 總體遺傳多樣性Kt= 1–ΣYi2, Yi指某一DNA類型(長度差異)在所有個體內的頻率。根據公式Cip= (mean Kc–Kb)/Kt和Cpt= (Kt–mean Kc)/Kt計算遺傳差異在群體內和群體間所占比例[28]。

2 結果

2.1 控制區序列長度和堿基組成

對黃鯽控制區序列進行編輯和人工校正后, 得到黃鯽全序列長度為1193—1271 bp。35條序列共定義了6個單倍型, 檢測到9個變異位點, 其中9個位點均為轉換。以CSB-F起始位置和CSB-1起始位置分別為終止序列區和中央保守區、中央保守區和保守序列區的界線, 8個變異位點位于終止序列區內, 1個變異位點位于中央保守區,在保守序列區內未發現變異位點。同時, 在終止序列區內(165—437 bp)檢測到串聯重復序列(Tandem repeat sequence)結構, 重復序列單元長度為 39 bp, 重復次數為 5—7次。重復序列現象僅存在于個體間, 并沒有發現個體內異質性(Heterogeneous)現象。

以長度為1271 bp的控制區序列為例分析序列中堿基A、T、G、C的含量(表2)?？刂茀^全序列A+T含量(64.9%)高于 C+G含量, 這一結果與其他魚類控制區堿基組成相似。重復序列單元 A+T含量(79.5%)均高于全序列含量(64.9%)、終止序列區含量(72.4%)、中央保守區含量(57.1%)和保守序列區(55.9%)。

表2 黃鯽控制區序列堿基組成及長度Tab. 2 Nucleotide compositions and length of mitochondrial DNA control region of S. tenuifilis

2.2 終止序列區

終止序列區是控制區內變異最多的區域。黃鯽控制區終止序列區長度為592—670 bp, 在終止序列區前端發現串聯重復序列。參考鱭屬魚類線粒體DNA控制區擴展終止相關序列(Extended termination associated sequence, ETAS)特征序列[9]和 鲿科魚類ETAS特征序列[13], 確定黃鯽控制區ETAS特征序列為TACAT ACTATGCATTATATT ACAT, 與劉煥章[7]對ETAS的描述略有不同, 與Li等[23]的研究結果相似(圖 1), 且 ETAS包含在串聯重復單元中,黃鯽控制區終止序列區內存在5—7個ETAS。

圖1 黃鯽控制區終止序列區序列Fig. 1 Termination associated sequence of S. tenuifilis

2.3 中央保守區

中央保守區內含有多個保守序列。參照劉煥章[7]給出的 魚類中央保守區D、E、F 3個保守片段的特征序列及鱭屬魚類中央保守區D、E、F 3個保守片段的特征序列[9], 在黃鯽控制區中央保守區內共識別出CSB-D、CSB-E、CSB-F 3個保守序列。其中CSB-F序列為ATGTAG TA AGAAACCACC, CSB-E序列為AGGG ACAACTATTGTGGGGGACTG GCATCTG , CSB-D 序列為 TATT

GT, 與Li等[23]的研究結果相似(圖2)。CSB-E序列中發現 GTGGG-box, 且與鱭屬魚類 CSB-E序列相同, 其他2個序列與鱭屬魚類特征序列分別存在1個堿基差異[9]。

2.4 保守序列區

參照鱭屬魚類的CSB-1、CSB-2和CSB-3的特征序列, 我們識別出黃鯽的3個保守序列區片段。CSB-1的序列為TTGATAGAAGAATTGCATAA; CSB-2和CSB-3的序列分別為AAACCCCCTTACCCCC和TGTCAAACCCC GAAA, 與Li等[23]的研究結果相似(圖2)。

圖2 黃鯽控制區中央保守區和保守序列區序列Fig. 2 Central conserved domain and conserved sequence block sequence of S. tenuifilis

2.5 重復序列

對202尾黃鯽個體的控制區高變區序列進行3%瓊脂糖凝膠電泳(U = 100V), 發現個體間存在長度多態性現象(圖 3)。對黃鯽控制區高變區序列進行正反鏈測序, 測序結果顯示黃鯽控制區高變區存在長度為39 bp的重復序列單元, 重復次數為 5—7次。結合瓊脂糖凝膠電泳圖及測序結果, 統計黃鯽控制區重復序列單元頻率, 結果顯示 6次重復的個體最多, 其次為7次重復個體, 5次重復個體最少, 僅出現在東營、煙臺、南通和溫州群體內; 北部灣群體內7次重復個體較多, 其他6個群體均為6次重復個體比例較大(圖4)。在重復序列頻率上, 卡方檢驗結果(表3)顯示北部灣群體與其他 6個群體存在極顯著的差異(χ2＞16.655, P=0.000), 其他各群體間差異不顯著(χ2＜2.945, P ＞ 0.229)。

使用RNAstructure軟件分析、構建重復序列二級結構, 發現重復序列能夠形成穩定的莖環結構并釋放一定的自由能(圖5), 5次重復序列釋放的自由能為–24.2 kcal/M; 6次重復序列釋放的自由能為–28.7 kcal/M; 7次重復序列釋放的自由能為–34.2 kcal/M。隨著重復次數的增加, 重復序列形成的二級結構越來越穩定, 釋放的自由能也越來越高。

對黃鯽控制區重復序列遺傳多樣性和群體遺傳差異進行分析比較, 結果顯示 7個群體遺傳多樣性(Kc)為0.255—0.423, 平均為 0.347; 所有個體遺傳多樣性為0.435。79.77%的遺傳差異來自群體內個體間, 而20.23%的遺傳差異來自群體間(表4)。

圖3 黃鯽控制區高變區長度多態性(以東營群體為例)Fig. 3 Length polymorphism in hypervariable region I of S. tenuifilis in population Dongying

表3 兩兩群體間卡方檢驗結果(對角線下側為χ2值, 對角線上側為P值)Tab. 3 Pairwise χ2(below diagonal) and P values (above diagonal) among S. tenuifilis populaitons

圖4 黃鯽7個群體重復序列頻率Fig. 4 Frequency of tandem repeat sequence in seven populations of S. tenuifilis

表4 黃鯽群體重復序列遺傳多樣性和遺傳差異分析結果Tab. 4 Results of genetic diversity and genetic differentiation of seven populations of S. tenuifilis

3 討論

3.1 黃鯽控制區結構

黃鯽控制區結構與其他海洋魚類相似, 通過比對其他魚類的控制區結構, 我們發現在黃鯽控制區終止序列區內存在5—7個擴展終止相關序列(ETAS), 這一重復片段也是造成黃鯽控制區長度多態性的主要原因。同時, 在中央保守區和保守序列區內分別識別6個保守序列(CSBD—F和CSB-1—3)。

終止序列區是魚類控制區內變異積累最多的區域,重復序列也多發生在終止序列區。朱世華等[13]發現在康氏似 鲹(Scomberoides commersonianus)的控制區終止序列區內存在串聯重復序列, 在中華鱘[14](Acipenser sinensis)、高首鱘[29](Acipenser transmontanus)控制區終止序列區內也發現重復序列, 且在康氏似 鲹和高首鱘控制區內存在多個 TAS。黃鯽控制區結構分析的研究中, 張博[24]在終止序列區內發現5個ETAS, Li等[23]發現7個ETAS。本研究中, 黃鯽控制區ETAS出現頻率為5—7次, 呈現個體間長度多態性。

中央保守區是整個控制區中最為保守的區域[30],Southern等[31]識別出哺乳動物中央保守區B、C、D、E、F 5個保守序列; Randi和Lucchini[32]識別了鳥類中央保守區C、D、E、F 4個保守序列。但在多種魚類[7—13]中僅識別3個保守片段(CSB-D、E、F)。對黃鯽的中央保守區進行分析, 也僅識別了 CSB-D、E、F等保守片段, 并沒有發現CSB-B和CSB-C序列。

圖5 重復序列二級結構及自由能Fig. 5 Predicted secondary structure and free energy of tandem repeat sequences

保守序列區可能是控制區中最為重要的區域, 其包含有H鏈復制起始區(OH)、H鏈啟動子(HSP)、L鏈啟動子(LSP)和 3個保守片段(CSB-1—3)等多個功能區域[30],其中 CSB-1是區分中央保守區和保守序列區的標志, 其變異較大, 而 CSB-2和 CSB-3相對保守[7]?，F已識別出多種魚類保守序列區的保守片段并給出各保守片段的一般形式[7—15]。在黃鯽保守序列區內并沒有發現CSB-1的特征序列(GACATA), 參照鱭屬魚類等的CSB-1特征序列,我們發現黃鯽的CSB-1序列為TTGATAGAAGAATTGC ATAA。CSB-2和CSB-3序列相對保守。

3.2 黃鯽控制區重復序列

黃鯽控制區終止序列區出現多個串聯重復序列, 且個體間重復次數不同。串聯重復序列形成機制較多, 如重組(Recombination)和轉座(Transposition)[16]、不等交換(Unequal crossing over)或基因轉換(Gene conversion)[33]、滑鏈(Strand slippage)[34]等。由于脊椎動物線粒體DNA中一般不發生重組現象[35], 滑鏈錯配(Slipped-strand mispairing)是最有可能形成串聯重復序列的機制。這一機制在核基因中也同樣存在[36,37]。目前仍需要深入研究以確定決定重復次數頻率的機制。

重復序列頻率差異可能應用于群體比較和種類鑒別。Stepien等[38]對梅花鱸(Gymnocephalus cernua)重復序列多態性進行分析研究, 發現梅花鱸各地理群體間重復序列頻率差異顯著; Broughton和 Dowling[39]對斑鰭真小鯉(Cyprinella spiloptera)重復序列進行統計分析, 發現其地理群體間重復序列頻率存在顯著差異; Cesaroni等[40]對2個群體的歐洲鱸魚(Dicentrarchus labrax)的線粒體重復序列進行分析, 發現串聯重復序列頻率能夠較好的將 2個群體區分開; 但Miracle和Campton[41]對尖吻鱘(Acipenser oxyrhynchus desotoi)的線粒體重復序列進行分析, 沒有發現重復序列頻率與地理分布存在相關性。Li等[23]利用線粒體DNA控制區序列對中國近海5個黃鯽群體進行遺傳學分析, 結果顯示東海海域與黃海海域黃鯽群體間不存在顯著的遺傳差異; 張博[24]利用微衛星標記方法對中國近海5個黃鯽群體進行分析, 發現東海海域與黃海海域黃鯽群體間存在顯著的遺傳分化; Xu等[25]利用線粒體 DNA控制區序列對中國近海 7個黃鯽群體進行遺傳學分析,發現中國沿海黃鯽群體可分為黃渤海組群、東海組群和南海組群, 各組群間存在較大的遺傳差異。在本研究中, 對黃鯽控制區重復序列頻率進行統計分析, 卡方檢驗結果顯示北部灣群體與其他 6個群體間差異極顯著, 這一結果與Xu等[25]的研究結果相似, 佐證了南海組群與其他組群存在遺傳差異, 但并未發現東海海域群體與黃渤海海域群體間的遺傳差異。僅通過重復序列頻率不能將北部灣群體與其他群體完全區分, 重復序列頻率可能作為一種補充和輔助手段用于群體遺傳學研究。

致謝:

感謝孫典榮研究員、李龍、李淵為本研究采集黃鯽樣品！

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MITOCHONDRIAL DNA CONTROL REGION STRUCTURE AND LENGTH POLYMORPHISM ANALYSIS OF SETIPINNA TENUIFILIS

CAI Shan-Shan1, XU Sheng-Yong1, SONG Na1, GAO Tian-Xiang1and ZHANG Zhao-Hui2
(1. Institute of Evolution & Marine Biodiversity, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. The First Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Qingdao 266061, China)

黃鯽; 控制區; 結構; 串聯重復序列; 長度多態性

Setipinna tenuifilis; control region; Structure; Tandem repeat sequence; Length polymorphism

Q346+.5

A

1000-3207(2014)05-0980-07

2014-04-09;

2014-06-13

國家海洋公益性行業科研專項經費項目(201305030, 201405010); 中央高?；究蒲袠I務費專項資金項目(201262022)資助

蔡珊珊(1990—), 女, 山東濰坊人, 碩士研究生, 主要從事漁業生態學研究。E-mail: cssrsjzdw110@163.com

張朝暉(1970—), 男, 副研究員; E-mail: zhang@fio.org.cn