日糧能量水平對幼齡獺兔血液生化指標及肝臟PPARγ、INSIG-2基因表達的影響

宋洪新，任戰軍，楊雪嬌，賀國瑞，韓 營，常萬波，頡宏兵

(1 西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100；2 甘肅康園有限公司，甘肅 甘谷 741200)

過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(PPARγ)是調控脂肪細胞分化及調節糖脂代謝的重要酶類[1]。在動物生長期，PPARγ能控制脂肪的儲存和釋放，維持機體能量平衡和血糖的穩定[2]?，F有研究表明，PPAR-γ確實與糖脂代謝關系密切，而且PPAR-γ的高表達可能改善糖脂的代謝情況[3-4]。胰島素誘導基因2 (Insulin induced gene 2, INSIG-2) 是胰島素誘導基因(Insulin induced gene,INSIG)的一個亞型[5]，是調控脂肪細胞分化和脂類代謝的重要基因，可以調節脂肪合成所需的多種酶的轉錄[6]，在維持體內膽固醇代謝穩定方面也具有十分重要的作用。INSIG-2與PPARγ均與體內脂質代謝紊亂的發生和發展存在密切關系，因此日益受到人們的關注，有關二者的研究也越來越多，但是有關日糧能量水平對PPARγ、INSIG-2基因表達的影響研究尚較少。本試驗以幼齡獺兔為研究對象，通過飼喂不同能量水平的飼料，檢測能量水平對其血液指標及INSIG-2、PPARγ基因表達量的影響，旨在從基因水平闡明日糧能量水平對幼齡獺兔糖脂代謝影響的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物及飼養管理 健康狀況良好、體質量相近的160只斷奶(45日齡)獺兔，由甘肅省甘谷縣康園兔業有限公司提供。

1.1.2 試驗日糧 試驗日糧參照美國NRC(1977)及法國AEC(1993)獺兔的營養需要量，設計能量水平分別為9.7，10.5，11.3，12.1 MJ/kg的4種日料，日糧其他營養成分基本相同，分別含粗蛋白16.5%(質量分數)、粗纖維13%(質量分數)。將日糧加工成直徑為4～6 mm 的顆粒飼料備用。

1.1.3 主要試劑及儀器 DNaseⅠ、β-巰基乙醇、TaqDNA聚合酶、oligo(dt)、瓊脂糖、RNAprep Pure 動物組織總RNA提取試劑盒(由上海天根生物有限公司提供)、Fast Quant Cdna第1鏈合成試劑盒(由上海天根生物有限公司提供)。

低溫高速冷凍離心機、電泳儀、水平電泳槽、Gel Doc 2000凝膠成像系統、梯度PCR儀、Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(購自美國Thermo Scientific科技有限公司)、CFX96TM Real-Time System 實時熒光定量PCR儀(購自美國BIO-RAD公司)。

1.2 試驗設計

試驗在甘肅省甘谷縣康園(兔業)有限公司進行，試驗日期為2012-04-07-06-15，預試期7 d，正試期分為斷奶～2月齡和2～3月齡2個階段。將160只供試獺兔隨機分為1，2，3，4共4組，每組40只，單籠飼養，分別飼喂能量水平為9.7，10.5，11.3和12.1 MJ/kg的4種日糧。試驗期間每日喂食2次，自由采食，自由飲水。

1.3 日糧能量水平對幼齡獺兔血液生化指標的影響

分別于試驗開始后的第30、60天早晨，每組隨機選取6只試驗兔，空腹稱體質量后，心臟采血10 mL/只，肝素鈉抗凝，室溫避光靜置15 min后，3 000 r/min離心10 min，將分離所得血清分裝于Eppendorf管中，于-20 ℃下冷凍保存待測。血液指標由楊凌示范區醫院檢測，測定指標包括葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、總蛋白(TP)、總膽固醇(TC)、高密度膽固醇(HDLC)、低密度膽固醇(LDLC)含量及谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)活性。

1.4 日糧能量水平對幼齡獺兔肝臟中PPARγ、INSIG-2基因表達的影響

1.4.1 引物設計及合成 參照GenBank 公布的兔PPARγ基因序列、INSIG-2基因序列和GAPDH序列，用primer5.0軟件設計引物，交由上海生工生物技術有限公司合成。引物序列見表1。

表1 PPARγ、INSIG-2基因及內參基因GADPH的引物序列

1.4.2PPARγ、INSIG-2基因相對表達量的檢測 供試獺兔采血后立即屠宰，快速采取肝臟組織相對固定部位樣品，放入無酶的Eppendorf管中，每管約0.5 g，每只兔做2管重復，液氮速凍后于-70 ℃保存，用于RNA定量檢測。

(1)總RNA的提取。用RNAprep Pure 動物組織總RNA提取試劑盒提取肝臟總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，用紫外分光光度計測定總RNA純度和濃度，并分別在230，260和280 nm下測定吸光度(OD230、OD260、OD280)，計算OD260/OD280和OD260/OD230值。若RNA樣品的OD260/OD280=2.0±0.1，且OD260/OD230值為1.8～2.1，說明提取的RNA純度較高,適宜進行下一步試驗。

(2)反轉錄。用RNase-Free ddH2O將RNA提取液的質量濃度稀釋到50～200 ng/mL。并將試劑在室溫下解凍后置冰上保存，且以下所有操作均在冰上進行。

cDNA第1鏈的合成：取200 μL的RNase-Free 管，加入2 μL RNA提取液、4 μL gDNA、14 μL RNase-Free ddH2O，42 ℃下PCR 孵育3 min后，取出放置在冰上。然后加入4 μL的10×Fast RT Buffer、2 μL的RT Enzyme Mix、4 μL的FQ-RT Primer Mix、10 μL的RNase-Free ddH2O，42 ℃下PCR 孵育15 min，95 ℃下PCR 孵育3 min后得到cDNA樣品，取出放置在冰上，分裝2管，每管20 μL，-20 ℃保存。

(3)PCR反應。以GADPH為內參基因，進行實時熒光定量PCR擴增。PPARγ、INSIG-2基因PCR擴增的反應體系為：2×UItraSYBR Mixture 5 μL、Template DNA 1 μL、上、下游引物各0.2 μL，RNase-Free ddH2O 3.6 μL。采用兩步法進行PCR反應，PCR擴增的反應條件為：95 ℃ 15 min，95 ℃ 10 s，55 ℃退火60 s，40個循環。融解曲線分析：設置融解曲線溫度為60～95 ℃，讀取PPARγmRNA、INSIG-2 mRNA和GAPDHmRNA的ΔCt值，以GAPDH作為參照基因，用2-ΔΔCt法計算PPARγ、INSIG-2基因的相對表達量。每個樣本重復3次。

1.5 數據處理

采用SPSS(1.8版本)程序對試驗數據進行單因素方差分析和顯著性檢驗，用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 日糧能量水平對幼齡獺兔血液生化指標的影響

2.1.1 2月齡獺兔的血液生化指標 從表2可以看出，對于2月齡的獺兔，其血液中的葡萄糖、甘油三酯和總蛋白質含量及乳酸脫氫酶活性均隨日糧能量水平的升高而先升高后降低，且均以第3組最高，但各組之間差異不顯著；總膽固醇含量逐漸上升，2組與3組含量基本相同，1組與4組之間差異極顯著(P<0.01)；高密度膽固醇含量總體呈持續上升趨勢，2組和3組含量基本相同，1組與4組之間差異顯著(P<0.05)；低密度膽固醇含量呈持續上升趨勢，2組和3組含量基本相同，1組與4組之間差異顯著(P<0.05)；谷丙轉氨酶活性呈逐漸下降趨勢，各組之間差異不顯著；谷草轉氨酶活性呈下降趨勢，1組含量最高，與2、3、4組之間差異極顯著(P<0.01)；堿性磷酸酶活性先上升后下降，以第3組最高，但各組之間差異不顯著。

2.1.2 3月齡獺兔的血液生化指標 從表3可以看出，對于3月齡的獺兔，隨著日糧能量水平的升高，其血液中的葡萄糖含量先上升后下降，以第3組含量最高，各組之間差異不顯著；甘油三酯含量呈持續上升趨勢，各組之間差異不顯著；總蛋白質含量先上升后下降，但下降趨勢不明顯，以第3組含量最高，1組與3組之間差異極顯著(P<0.01)，1組與4組之間差異顯著(P<0.05)；總膽固醇含量持續上升，且上升趨勢比較明顯，1組與4組之間差異顯著(P<0.05)；高密度膽固醇含量先上升后下降，以第3組含量最高，各組之間差異不顯著；低密度膽固醇含量呈持續上升趨勢，各組之間差異不顯著；谷丙轉氨酶先上升后下降，以第1組活性最低，第3組活性最高，2組與3組活性比較接近，各組之間差異不顯著；谷草轉氨酶活性呈下降趨勢，1組與4組之間差異顯著(P<0.05)；堿性磷酸酶活性先上升后下降，以第3組活性最高，第1組活性最低，各組之間差異不顯著；乳酸脫氫酶活性先上升后下降，以第3組活性最高，第4組活性最低，各組之間差異不顯著。

表2 日糧能量水平對2月齡獺兔血液生化指標的影響

表3 日糧能量水平對3月齡獺兔血液生化指標的影響

2.2 日糧能量水平對幼齡獺兔肝臟PPARγ、INSIG-2基因表達的影響

2.2.1PPARγ基因的表達 從表4可以看出，對2月齡獺兔來說，隨著日糧能量水平的升高，肝臟PPARγ基因的相對表達量也逐漸升高，以第3組的表達量最高，第1組與2、3、4組之間差異極顯著(P<0.01)；對3月齡獺兔來說，隨著日糧能量水平的升高，肝臟中PPARγ基因的相對表達量也逐漸升高，但升高幅度很小，以第4組表達量最高，3組與4組之間的表達量基本相同，1組與4組之間差異顯著(P<0.05)?？傮w來看，3月齡獺兔肝臟PPARγ基因的相對表達量較2月齡高。

表4 日糧能量水平對幼齡獺兔肝臟PPARγ基因相對表達量的影響

2.2.2INSIG-2基因的表達 從表5可以看出，對2月齡獺兔來說，隨日糧能量水平的升高，肝臟INSIG-2基因的相對表達量呈先上升后下降趨勢，以第3組表達量最高，1組與3組之間差異顯著(P<0.05)；對3月齡獺兔來說，隨日糧能量水平的升高，肝臟INSIG-2基因的相對表達量呈逐漸下降趨勢，以第1組表達量最高，1組與4組之間差異極顯著(P<0.01)，2組與4組之間差異顯著(P<0.05)。

表5 日糧能量水平對幼齡獺兔肝臟INSIG-2基因相對表達量的影響

3 討 論

3.1 日糧能量水平與血液生化指標

血液生化指標能夠反映動物機體的物質代謝水平和某些組織器官的機能狀態[7]。正常情況下，動物體內各血液生化指標的量值呈相對穩定狀態，但不同的日糧組成卻能通過影響動物的血液生化值，進而影響動物機體的代謝以及健康狀況。

葡萄糖作為重要的營養性單糖，是機體新陳代謝的能源物質。血液中的葡萄糖含量與動物能量攝入量有關[8]，可以反映機體的能量代謝水平。本試驗發現，隨著日糧能量水平的升高，2、3月齡獺兔血液中的葡萄糖含量均先上升后下降，但變化幅度不大，表明血液中的葡萄糖含量在一定范圍內會隨日糧能量水平的升高而升高，但機體可以通過葡萄糖-脂肪酸代謝途徑來調節血液中的葡萄糖含量[9],以保證血液中的葡萄糖含量處于恒穩狀態，這與吳淑軍等[10]的研究結果一致。

甘油三酯和膽固醇是血液脂肪的組成部分，其水平可間接反映全身脂類代謝狀況，脂類在體內發生運輸障礙時，血脂含量會有所升高[11]。本試驗中，隨著日糧能量水平的升高，2、3月齡獺兔血液中的甘油三酯和膽固醇含量均呈上升趨勢，這與王宗偉等[12]的研究結果基本一致，表明高能量水平可以提高血液中的甘油三酯和膽固醇含量，且對膽固醇的影響更為明顯。

高密度膽固醇和低密度膽固醇是膽固醇的運輸者，本試驗中，隨著膽固醇含量的增高，二者也呈上升趨勢，表明隨著日糧能量水平的升高，高密度膽固醇和低密度膽固醇的含量也隨之升高。對于2月齡獺兔，日糧能量對高密度膽固醇的影響更顯著一些，對于3月齡獺兔，日糧能量對低密度膽固醇的影響更顯著一些。這可能與高密度膽固醇和低密度膽固醇的功能不同有關，低密度膽固醇的功能主要是將膽固醇從肝臟運送到全身組織，高密度膽固醇的功能正好相反，是將各組織中的膽固醇運送回肝臟。對于2月齡獺兔來說，日糧能量水平越高，血液中的膽固醇含量越高，這時需要高密度膽固醇將血液中的膽固醇運送到肝臟中進行代謝；而3月齡獺兔由于長時間飼喂高能日糧導致體內沉積的膽固醇含量較高，肝臟不能快速對其進行代謝，所以向肝臟運送膽固醇的高密度膽固醇含量就會減少，從肝臟運出膽固醇的低密度膽固醇含量就有所增多。

血液中總蛋白含量的多少,可以反映機體蛋白質攝取量的多少[13]，本試驗高能組血液中總蛋白含量的下降，主要是因為采食量下降引起的。日糧能量過高，獺兔采食量下降，導致蛋白質的攝入量也隨之下降。

酶是動物機體新陳代謝的有效調節劑，酶活性的大小直接影響著動物的新陳代謝水平,進而影響動物的健康和生長狀況[14]。谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶在氨基酸代謝中起重要作用，二者活性升高時，可使蛋白質分解代謝下降，合成代謝加強，有利于氮在體內的蓄積，動物生長較快[14]。本試驗中，隨著日糧能量水平的升高，這2種酶總體呈下降趨勢，表明機體的氨基酸代謝水平隨著日糧能量水平的升高而有所下降。堿性磷酸酶和乳酸脫氫酶都是與生長發育和消化代謝有關的重要酶，堿性磷酸酶是消化代謝的關鍵酶，其活性在一定程度上可以反映獺兔的生長速度[15]。本試驗中，隨著日糧能量水平的升高，堿性磷酸酶的活性先上升后下降，表明在一定的能量范圍內，隨著能量水平的升高，堿性磷酸酶活性升高，但影響不顯著。乳酸脫氫酶是機體能量代謝過程中參與糖酵解的一種重要酶，與血糖含量有關，本試驗中，能量水平對乳酸脫氫酶含量的影響不顯著?？傮w來說，日糧能量水平對幼齡獺兔血液中的總蛋白質、總膽固醇、高密度膽固醇、低密度膽固醇和谷草轉氨酶含量都有顯著影響，但對其他血液指標的影響相對較小。

3.2 日糧能量水平與PPARγ、INSIG-2基因的表達

PPARγ不僅調控機體的脂肪代謝、維持能量平衡和血糖的穩定，同時又調控著參與脂類代謝的相關基因的表達[2]。本試驗結果表明，隨著日糧能量水平的升高，PPARγ基因的表達量也相應增高，2、3月齡獺兔PPARγ基因的表達量分別在日糧能量水平為11.3和12.1 MJ/kg時達到最高值，且3月齡獺兔PPARγ基因表達量總體高于2月齡，說明高能量水平的日糧能促進PPARγ基因的表達。

INSIG-2在維持體內膽固醇代謝穩定方面也具有十分重要的作用。本試驗中，INSIG-2基因在2、3月齡時分別于11.3 和9.7 MJ/kg的日糧能量水平下表達量最高。INSIG-2基因的表達量并非簡單地隨血液膽固醇含量的變化而變化，而可能與INSIG-2在調控脂類代謝的同時也調控參與脂類代謝所需的多種酶的表達有關，INSIG-2、PPARγ在其他一些與糖脂代謝有關的酶的共同作用下，對動物機體的糖脂代謝進行調控，在這一復雜的機制下，使INSIG-2基因的表達量不會簡單地隨著日糧能量水平的升高而升高。有關日糧能量水平對其他與糖脂代謝有關基因表達量的影響，以及各種基因調控糖脂代謝的機制還有待進一步研究。

4 結 論

2月齡時，日糧能量水平對獺兔血液中的總膽固醇、高密度膽固醇、低密度膽固醇含量和谷草轉氨酶活性有顯著影響；3月齡時，日糧能量水平對獺兔血液中的總蛋白質、總膽固醇含量和谷草轉氨酶活性有顯著影響。2、3月齡時，日糧能量水平對幼齡獺兔肝臟PPARγ、INSIG-2基因的表達量均有顯著影響，在2、3月齡獺兔肝臟中，PPARγ基因分別在11.3和12.1 MJ/kg 日糧能量水平下的表達量最高，INSIG-2基因則分別于11.3 和9.7 MJ/kg的日糧能量水平下表達量最高。

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