升血顆粒質量標準研究

戴曉雁，王玉潔，魏學兵

1 甘肅省腫瘤醫院，甘肅 蘭州 730050；2 甘肅省藥品檢驗所

升血顆粒質量標準研究

戴曉雁1，王玉潔1，魏學兵2

1 甘肅省腫瘤醫院，甘肅 蘭州 730050；2 甘肅省藥品檢驗所

目的：建立升血顆粒的質量標準。方法：采用薄層色譜（TLC）法對升血顆粒中山茱萸、黃芪、丹參、麥門冬進行定性鑒別；采用高效液相色譜法對升血顆粒中馬錢苷的含量進行定量測定。結果：TLC斑點清晰、分離度好，陰性對照無干擾；馬錢苷進樣量在0.0752～0.451μg/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系（r＝0.9983），平均加樣回收率為96.2％，RSD＝2.3％（n＝6）。結論：所建立的標準可用于升血顆粒的質量控制。

升血顆粒；質量標準；薄層色譜法；高效液相色譜法

升血顆粒是甘肅省腫瘤醫院院內制劑（甘藥制字Z04410885），由山茱萸、黃芪、丹參、麥門冬等20余味中藥組成，具有健脾益腎，益氣生血，升高白細胞、血小板及補血作用，可明顯減輕放、化療的毒副反應，減緩放、化療血象下降，增強機體免疫力［1-6］。本研究對處方中山茱萸、黃芪、丹參、麥門冬進行薄層色譜（TLC）鑒別，并對方中主藥山茱萸有效成分馬錢苷的含量采用高效液相色譜（HPLC）法進行測定，建立制劑的質量標準，以期有效控制制劑質量，從而達到確保臨床療效的目的。

1 材料

1.1 儀器與試藥 Waters 515液相色譜儀（美國Waters公司）；AE260型萬分之一電子天平（瑞士Mett1e公司）；CP225D型十萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯公司）；超聲波清洗儀［必能信超聲（上海）有限公司］；快速開蓋萬能高速粉碎機（上海市晟喜制藥機械有限公司）；硅膠G板（青島海洋化工廠分廠）；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。熊果酸對照品（批號：110742-200516）；馬錢苷對照品（批號：110726-200521），黃芪甲苷對照品（批號110781-200512），丹參對照藥材（批號：120923-200408），麥門冬對照藥材（批號：121013-200607）均購自中國藥品生物制品檢定所。升血顆粒（批號：20090423、20090425、20090524）、陰性對照品（批號：20090528）由甘肅省腫瘤醫院制劑室提供。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜（TLC）鑒別

2.1.1 山茱萸薄層色譜（TLC）鑒別 取本品6g，加乙醇25mL，加熱回流1小時，濾過，濾液蒸干，殘渣用石油醚（60～90℃）浸泡2次，15mL/次，傾去石油醚液，殘渣加乙醇2mL使溶解，作為供試品溶液。取不含山茱萸的陰性樣品6g，按上述方法制備陰性對照溶液。另取熊果酸對照品，加乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法（《中國藥典》2005年版附錄VIB），吸取上述3種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷∶三氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲酸（20∶5∶8∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365nm）下檢視［7］。結果顯示，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同斑點；陰性對照無相應斑點，結果見圖1-A。

2.1.2 黃芪薄層色譜（TLC）鑒別 取本品6g，研細，置三角燒瓶中，加甲醇超聲提取3次（25、30、30mL），15min/次，過濾，合并濾液，蒸干，殘渣加20mL水溶解，置分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取4次（25，25，20，20mL），合并正丁醇液，用氨試液提取3次（20，20，20mL），棄去氨液，正丁醇蒸干，用甲醇溶解并轉移至5mL容量瓶內，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。取不含黃芪的陰性樣品6g，按上述方法制備陰性對照溶液。取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法（《中國藥典》2005年版附錄VIB），吸取上述3種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿∶甲醇∶水（30∶10∶1）［8］為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃烘烤約5分鐘，至斑點顯色清晰。結果顯示，供試品色譜中在與對照品色譜相應的位置上，顯相同棕色斑點，陰性樣品無相應斑點，結果見圖1-B。

2.1.3 丹參薄層色譜（TLC）鑒別 取本品6g，加水50mL使溶解，加熱煮沸15分鐘，過濾，濾液用鹽酸調pH2～3，加乙酸乙酯萃取2次，10mL/次，合并乙酸乙酯液蒸干，殘渣加乙酸乙酯5mL使溶解，作為供試品溶液。取不含丹參的陰性樣品6g，按上述方法制備陰性對照溶液。取丹參對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液。按照薄層色譜法（《中國藥典》2005年版附錄VIB），吸取上述3種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸（80∶50∶8）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2％三氯化鐵乙醇溶液，105℃烘至斑點顯色清晰［9］。結果顯示，供試品色譜中在與對照藥材色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性樣品無相應斑點，結果見圖1-C。

2.1.4 麥門冬薄層色譜（TLC）鑒別 取本品6g，研細，加甲醇30mL，超聲處理（功率120W，頻率40KHz）30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20mL、鹽酸1mL，加熱煮沸5分鐘，放冷。用乙醚振搖提取3次，30mL/次，合并乙醚液，揮干，殘渣加乙醇1mL使溶解，作為供試品溶液。取不含麥門冬的陰性樣品6g，按上述方法制備陰性對照溶液。取麥門冬對照藥材2g，加水，煎煮10分鐘，濾過，濾液加鹽酸1mL同法制成對照藥材溶液。按照薄層色譜法（《中國藥典》2005年版附錄VIB），吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯（3∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇液，在105℃加熱至斑點顯色清晰［10］。結果顯示，供試品色譜中在與對照藥材色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性樣品無相應斑點，結果見圖1-D。

圖1 升血顆粒中山茱萸、黃芪、丹參、麥門冬的薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 馬錢苷的含量測定

2.2.1.1 色譜條件 色譜柱：Luna C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：［四氫呋喃∶乙腈∶甲醇（1∶8∶4）］-0.05％磷酸溶液（10∶90），流速：1.0 1mL/min，進樣量：10μL，檢測波長：236nm，柱溫：40℃，理論板數不得低于4000。

2.2.1.2 溶液的制備 精密稱取本品6g，研細，加在40％甲醇預洗的中性氧化鋁柱（100～200目，4g，內徑1.5cm）上，用40％甲醇50mL洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘渣用50％甲醇使溶解，轉移至10mL量瓶中，加50％甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，用0.45μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。陰性對照溶液的制備：按處方比例及制備工藝，制備不含山茱萸的陰性對照品，并按照“2.1.1”項制成陰性對照溶液。對照品溶液的制備：取馬錢苷對照品適量，加50％乙醇制成每1mL含20μg的溶液，即得［11］。

2.2.1.3 系統適用性實驗 吸取供試品溶液、陰性對照品溶液及對照品溶液各10μL，按上述色譜條件進行檢測，結果顯示供試品中馬錢苷峰與對照品峰保留時間一致，并與樣品中其他組分達到很好分離，陰性對照品溶液中未出現相對應的峰，見圖2。

圖2 升血顆粒中馬錢苷HPLC色譜圖

2.2.1.4 線性關系考察 精密吸取馬錢苷對照品溶液（濃度15.04μg/mL）5、10、15、20，25，30μL進樣，依“2.2.1.1”項色譜條件測定，以馬錢苷峰面積為縱坐標，馬錢苷對照品的量為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程C=9.0980×10-7A-3.4701×10-3，r=0.998 1。結果表明，馬錢苷在0.075 2～0.451 2μg范圍內呈良好的線性關系。

2.2.1.5 精密度 精密吸取馬錢苷對照品溶液10μL，重復進樣5次，測定馬錢苷峰面積，計算相對標準偏差，測得馬錢苷峰面積RDS為1.18％。

2.2.1.6 重復性 按“2.2.1”項供試品溶液的制備方法及色譜條件，重復測定同一樣品6次，馬錢苷含量平均值為0.146mg/g，RSD為2.3％。結果表明本方法重現性好。

2.2.1.7 穩定性 精密吸取供試品溶液10μL，按“2.2.1.1”項色譜條件，于0，2，4，6，8，12，18小時進樣，測定馬錢苷峰面積，RSD為2.5％。結果表明，供試品溶液在18小時內具有較好的穩定性。

2.2.1.8 回收率試驗 精密稱取本品3g，共取6份，分別精密加入馬錢苷對照品溶液（濃度為0.158mg/mL）1mL，按“2.2.1.1”項方法制備，進樣10μL，測定峰面積，計算含量。結果馬錢苷平均加樣回收率為96.2％，RSD為2.3％，見表1。

表1 回收率試驗結果

2.2.1.9 含量限度的確定 為確定升血顆粒中馬錢苷的含量限度，對3批次升血顆粒進行了馬錢苷含量測定。結果3批樣品（20090423、20090425、20090524）中馬錢苷含量分別為0.124、0.118、0.120mg/g。

3 討論

本制劑采用薄層色譜法對方中主藥山茱萸、黃芪、黨參和麥門冬進行定性鑒別，采用高效液相色譜法對山茱萸所含主要成分馬錢苷進行含量測定，能夠對方中各主藥進行質量控制，實驗結果表明，本方法操作簡便、專屬性強、重復性好、陰性無干擾，所建立的標準可有效控制該制劑的質量。

TLC鑒別實驗中，對供試品溶液的制備方法、展開系統、顯色劑、硅膠板均做了大量的考察和比較，各供試品色譜圖與對照藥材、對照品色譜圖相應位置上顯相同顏色的斑點，供試品各斑點分離清晰，層析效果好，可以達到鑒別的目的。

采用HPLC法測定山茱萸中馬錢苷的含量，供試品組分多，成分復雜，故在供試品溶液的制備過程中，直接將研細的樣品粉末加在40％甲醇預洗的中性氧化鋁柱（100～200目，4g，內徑1.5cm）上，用40％甲醇50mL洗脫，收集流出液及洗脫液后作為供試品溶液，基本剔除了其他成分的干擾。使得樣品中馬錢苷峰形好，與雜質峰分離度高，并且有效除去了馬錢苷峰后雜質，使得色譜峰重現性好。

本實驗還比較了以甲醇-水［12］，乙腈-水［13］以及［四氫呋喃∶乙腈∶甲醇（1∶8∶4）］-0.05％磷酸溶液的不同比例作為流動相，結果采用［四氫呋喃∶乙腈∶甲醇（1∶8∶4）］-0.05％磷酸溶液（10∶90）為流動相時馬錢苷能得到較好的分離；供試溶液中待測組分與相鄰組分分離度好，陰性對照無干擾。

［1］許惠敏，郭紅云，張桂瓊，等.扶正升血顆粒對荷瘤小鼠NKCIFN-IL-2免疫調節網的影響［J］.衛生職業教育，2010，28（16）：81-82.

［2］王玉潔，魏學兵，柴艷冬，等.高效液相色譜法測定升血顆粒中的馬錢苷含量［J］.甘肅醫藥，2010，29（2）：152-154.

［3］王寧.裴氏升血顆粒對H22腫瘤細胞凋亡及p53、Caspase-3蛋白表達的影響［D］.蘭州：甘肅中醫學院，2008.

［4］王芳.裴氏升血顆粒對荷H22瘤小鼠血清EGF和IL-1的影響［D］.蘭州：甘肅中醫學院，2011.

［5］郭紅云，張永東，胡清榮，等.扶正升血顆粒對荷瘤小鼠細胞免疫和體液免疫功能的影響［J］.甘肅醫藥，2009，28（5）：347-349.

［6］魏愛青，張強，李興文.升血顆粒對進展期胃癌患者血清血管內皮生長因子的影響［J］.甘肅醫藥，2009，28（4）：277-280.

［7］沈蒙，劉起華，康玉玲，等.益髓生血顆粒質量標準研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（22）：47-49.

［8］鄧躍寧，夏厚林，程軍，等.川黃芪質量標準研究［J］.中藥與臨床，2010，1（2）：18-19.

［9］梁遠園，黃宇平.莪棱膠囊的薄層鑒別研究［J］.中國藥事，2012，26（5）：503-504.

［10］余淑珍，常星潔，嚴冬，等.麥貞花顆粒的薄層鑒別［J］.云南中醫中藥雜志，2012，33（7）：47-50.

［11］郭忠奎，胡嶸，張輝.HPLC測定六味地黃顆粒中馬錢苷的含量［J］.長春中醫藥大學學報，2009，25（4）：606.

［12］孫志明，焦亮，張志斐.HPLC同時測定山茱萸總苷分散片中莫諾苷和馬錢苷的血漿濃度［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（10）：174-176.

［13］杜小偉，范力力，王京輝.不同產地制山茱萸中馬錢苷的含量測定［J］.中國中藥雜志，2006，31（17）：1466-1467.

Study on Quality Standard of ShengXue Granules

DAI Xiaoyan1，WANG Yujie1，WEI Xuebing2
1 Gansu Provincial Cancer Hospital，Lanzhou 730050，China；2 Gansu Provincial Institute for Drug Control

Objective：To establish quality control of ShengXue granules.Methods：ShanZhuYu（Cornus officinalis），HuangQi（radix Astragalus），DanShen（radix salviae miltiorrhizae）and MaiMenDong［Ophitopogin japonicum（L.f）Ker.-Gawl.］in ShengXue granules were identified by TLC；the contents of loganin were determined by HPLC.Results：TCL figures were distinct and reproducible，the blank test showed no interference；loganin showed better linear relationship in the range between 0.0752 and 0.451 μg/mL and peak areas（r=0.998 3），average recovery rate was 96.2％，RSD=2.3％（n=6）.Conclusion：The standard could be used in quality control of ShengXue granules.

ShengXue granules；quality control；TLC；HPLC

R282.5

A

1004-6852（2014）01-0031-04

2013-06-27

戴曉雁（1978—），女，主管中藥師。研究方向：中藥制劑。