色譜法測定人血漿中萬古霉素的濃度

姜慧婷，陳冰，楊婉花

上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院藥劑科，上海 200025

色譜法測定人血漿中萬古霉素的濃度

姜慧婷，陳冰，楊婉花*

上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院藥劑科，上海 200025

目的：建立HPLC法和液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法檢測人血漿中萬古霉素的濃度，并分別與FPIA法進行比較。方法：HPLC法：100 μL血漿樣品加入等體積10%的高氯酸沉淀，振蕩離心后取上清液進樣。采用Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為35℃，流動相為0.05 mol·L-1KH2PO4（pH=3.2）-甲醇（74∶26，v/v），流速為1 mL·min-1，檢測波長為230 nm。LC-MS/MS法：100 μL血漿樣品用300 μL乙腈沉淀，振蕩離心后取上清液進樣。色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18（100 mm×2.1 mm，3.5 μm），柱溫為40℃，流動相為水（含0.1%甲酸）-乙腈（90∶10，v/v），流速為0.20 mL·min-1。采用電噴霧化離子源（ESI），多離子反應模式（MRM）檢測，萬古霉素和內標去甲萬古霉素的監測離子對分別為m/z 725.0→144.0和718.5→144.0。采用建立的HPLC法和LC-MS/MS法測定95份臨床樣本，并與FPIA法進行相關性和測定方法的偏倚分析。結果：HPLC法和LC-MS/MS法測定萬古霉素的線性范圍分別為1.2～96 μg·mL-1和0.4～96 μg·mL-1，低、中、高三種濃度質控品日內和日間相對標準差（RSD）均＜15%。兩種方法與FPIA法有很強的相關性（r=0.9621，P＜0.0001和r=0.9466，P＜0.0001），無明顯偏倚。結論：建立的HPLC和LC-MS/MS法快速、靈敏、準確，樣本測定結果與FPIA法無顯著差異，適用于萬古霉素的常規血藥濃度監測及人體藥物代謝動力學研究。

萬古霉素；高效液相；液相色譜-串聯質譜；熒光偏振免疫法

萬古霉素（vancomycin）是一種糖肽類抗生素，對革蘭陽性菌有較強的殺菌作用，尤其適用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的感染[1]。以往的研究發現，老年人、長療程和萬古霉素谷濃度過高（30～65 μg·mL-1）是萬古霉素引起腎毒性的危險因素，并且合用氨基糖苷類抗生素后腎毒性的發生率大大提高，因此建議長療程、高濃度藥物維持的患者，合并其他耳腎毒性藥物和腎功能不全患者，老年、新生兒等特殊群體患者須進行常規血藥濃度監測。實施個體化用藥，以保證用藥的安全性和有效性，同時減少耐藥菌產生的幾率[2]。

目前國內外對萬古霉素的血藥濃度監測方法有微生物法、熒光偏振免疫（FPIA）法、高效液相色譜（HPLC）法、液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法等[3]。臨床多采用基于免疫原理的FPIA法，但是需要專門儀器，且專用試劑盒需從國外進口，若供應中斷的情況下，臨床萬古霉素血藥濃度監測無法正常進行。國內已有較多采用HPLC法測定萬古霉素血藥濃度的文獻報道。而LC-MS/MS法則有檢測食品中萬古霉素的殘留量的報道，樣品處理需經過萃取和凈化過程，時間過長且步驟繁瑣，不適用于臨床樣本的測定[4-5]。本文參考了相關文獻[6-9]，建立了HPLC法和LC-MS/MS法快速準確測定血漿中萬古霉素的濃度。

1 材料

1.1 儀器

Aglient 1100系列高效液相色譜儀（美國Aglient公司）；API4000型三重四級桿質譜儀（美國Applied Biosystems公司），配備電噴霧離子化源（ESI）以及Analyte 1．5．1數據處理軟件；Prominence 20A液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；TDL-5型低速大容量離心機（上海安亭科學儀器廠）；BS224S型精密天平（德國賽多利斯公司）；XW-80A型漩渦混合器（上海醫大儀器廠）；Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司）。

1.2 藥品和試劑

萬古霉素對照品（純度＞90%，大連美倫生物技術有限公司，批號：20120601）；內標去甲萬古霉素（純度＞95%，華北制藥股份有限公司，批號：12070202）；磷酸二氫鉀（上海振欣試劑廠，批號：20120305）；乙腈和甲醇（色譜純，美國Tedia公司）；其余試劑均為分析純；試驗用水為純水。

2 方法與結果

2.1 HPLC法

2.1.1 色譜條件色譜柱：Agilent Eclipse XDBC18（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動相：0．05 mol·L-1KH2PO4（pH=3．2）-甲醇（74∶26）；流速：1 mL·min-1；柱溫：35℃；檢測波長：230 nm。

2.1.2 對照品血漿和內標溶液的配制精密稱取萬古霉素對照品4．8 mg，加入1 mL純水溶解，依次用純水稀釋成以下濃度：960、480、240、120、60、30、12、4．0 μg·mL-1作為工作液。再分別取對照品工作液各10 μL，加入空白血漿90 μL，稀釋成濃度分別為96、48、24、12、6．0、3．0、1．2、0．4 μg·mL-1的對照品血漿。

精密量取內標去甲萬古霉素8．0 mg，加1 mL純水溶解使濃度為8．0 mg·mL-1去甲萬古霉素標準儲備液，將儲備液用純水稀釋至150．0 μg·mL-1。

以上儲備液及內標溶液均保存在4℃冰箱內備用。

2.1.3 血漿樣品處理精密吸取血漿樣品100 μL，加入20 μL內標溶液（150．0 μg·mL-1去甲萬古霉素），混勻后加入10%高氯酸100 μL進行沉淀，渦旋振蕩30 s，13000 r·min-1離心10 min，取上層20 μL進樣。

2.1.4 方法專屬性考察分別取空白血漿、標準品血漿（加入內標）以及患者用藥后血漿（加入內標），按“2．1．3”項處理，進樣分析得色譜圖（見圖1）。萬古霉素和內標去甲萬古霉素保留時間分別為14．2 min和18．9 min，峰形良好，萬古霉素和內標能完全分離，血漿中內源性物質和患者使用的其它藥物均不干擾萬古霉素和內標的測定。

2.1.5 標準曲線和定量下限按照“2．1．2”項下方法配制不同濃度的系列對照品血漿。按“2．1．3”項方法處理標準品血漿，以血漿中待測物濃度與內標物濃度的比值為橫坐標X，以待測物與內標物的峰面積比值為縱坐標Y，用加權最小二乘法進行回歸運算，求得的直線回歸方程：Y=4．526X＋13．52（r=0．998，n=7）

圖1 萬古霉素和去甲萬古霉素（內標）的典型色譜圖

結果表明，萬古霉素血藥濃度在1．2～96 μg·mL-1范圍內線性關系良好。萬古霉素的定量下限為1．2 μg·mL-1（n=5，相對標準差RSD=7．35%，準確度RE= 98．67%）。

2.1.6 精密度與準確度試驗按照“2．1．2”項下方法配制低、中、高（5．75、23．0、92．0 μg·mL-1）3種濃度的萬古霉素標準品血漿，每種濃度5份，再按“2．1．3”項方法處理后同日內測定，依據當日各自的標準曲線計算萬古霉素的血漿濃度，考察日內精密度；連續3天同法操作，考察日間精密度，結果見表1。

表1 HPLC法的準確度與精密度（±s，n=5）

表1 HPLC法的準確度與精密度（±s，n=5）

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2.1.7 提取回收率試驗按照“2．1．2”項下方法配制低、中、高（5．75、23．0、92．0 μg·mL-1）3種濃度的萬古霉素標準品血漿，每種濃度5份，再按“2．1．3”項方法處理后進樣分析。另用等量純水代替空白血漿配置對照品溶液，每種濃度5份，按“2．1．3”項方法處理后進樣分析。以每一濃度前者峰面積與后者峰面積之比計算提取回收率，結果低、中、高三種濃度的血漿樣品的提取回收率分別為68．68%、54．52%、58．34%。

2.1.8 樣品穩定性考察

凍融穩定性：血漿樣品經歷3次冰凍-解凍循環后測定，萬古霉素低、中、高3種濃度的RSD分別為7．69%、3．57%、5．89%。

冷凍樣品的穩定性：血漿樣品在-40℃放置20 d后處理測定，萬古霉素低、中、高3種濃度的RSD分別為10．25%、4．78%、4．94%。

室溫放置6 h穩定性：在室溫放置6 h后處理測定，萬古霉素低、中、高3種濃度的RSD分別為8.64%、5.83%、7.38%。

血漿樣品進樣器穩定性：血漿樣品處理后置于進樣器24 h后，用當日處理的標準曲線計算，萬古霉素低、中、高3種濃度的RSD分別為13.25%、11.49%、6.30%。

結果表明，在上述穩定性考察條件下，萬古霉素均保持穩定，未出現明顯變化。符合生物樣品分析要求。

2.2 LC-MS/MS法

2.2.1 色譜條件色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動相：水（含0.1%甲酸）-乙腈（90∶10，v/v）；流速：0.20 mL·min-1；柱溫：40℃。

2.2.2 質譜條件采用電噴霧離子化電離源（ESI），多離子反應模式（MRM）檢測：源電壓：5.5 kV，源溫度：500℃，GS1氣體流速：25 psi，GS2氣體流速：25 psi，簾氣流速：10 psi。測定萬古霉素和去甲萬古霉素的離子對分別為m/z 725.0→144.0，m/z 718.5→144.0；兩者的解簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）分別為：53.6 eV和58.5 eV；27.3 eV和29.4 eV。

2.2.3 對照品血漿和內標溶液的配制對照品血漿的配制同“2.1.2”。將8.0 mg·mL-1去甲萬古霉素標準儲備液用乙腈稀釋至4.0 μg·mL-1，以此作為含內標的沉淀劑。以上儲備液及內標溶液均保存在4℃冰箱內備用。

2.2.4 血漿樣品處理精密吸取血漿樣品100 μL，加入300 μL內標溶液（4.0 μg·mL-1去甲萬古霉素）進行沉淀，渦旋振蕩1 min，置于高速離心機中13000 r·min-1離心10 min，取50 μL上清液，加入50 μL純水混勻，取5 μL進樣分析。

2.2.5 質譜分析和特異性分別取空白血漿、對照品血漿（加入內標溶液）和患者用藥后血漿（加入內標溶液）樣本，按“2.2.3”項方法處理，其典型色譜見圖2。萬古霉素和內標去甲萬古霉素的保留時間均為1.6 min，峰形良好，血漿中內源性物質和患者使用的其他藥物均不干擾萬古霉素和內標的測定。

圖2 萬古霉素和去甲萬古霉素的典型色譜圖

2.2.6 標準曲線及定量下限按照“2.2.3”項下方法配制不同濃度的系列對照品血漿。按“2.2.4”項方法處理后進行分析，記錄萬古霉素和內標去甲萬古霉素色譜峰面積。以待測物濃度為橫坐標X（μg· mL-1），以待測物與內標物的峰面積比值為縱坐標Y，用加權（W=1/X）最小二乘法進行回歸運算，求得的直線回歸方程Y=0.103X+0.0222（r=0.9997，n=8）。結果顯示，萬古霉素在0.4～96 μg·mL-1的范圍線性關系良好。最低定量限0.4 μg·mL-1濃度水平上，連續測定5份最低定量限樣本，準確度為104.9%，精密度為4.9%。

2.2.7 精密度和準確度按照“2.2.3”項下方法，分別配制含萬古霉素低、中、高（0.958、5.75、92.0 μg·L-1）3種濃度的質控血漿樣本。按照“2.2.4”項下方法處理樣本，每一濃度均為5份進樣分析，連續測定3天。根據當日標準曲線計算質控樣本的測定濃度，計算日內、日間精密度和準確度，結果見表2。

表2 LC-MS/MS法的精密度、準確度、提取回收率與基質效應（±s，n=5）

表2 LC-MS/MS法的精密度、準確度、提取回收率與基質效應（±s，n=5）

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2.2.8 提取回收率和基質效應按照“2.2.4”項下方法處理低、中、高（0.958、5.75、92.0 μg·L-1）3種濃度的質控血漿樣本，每一濃度均為5份，進樣分析后獲得峰面積A；取空白血漿若干，加入3倍體積乙腈沉淀處理后獲得上清液，另取10 μL低、中、高3種濃度的工作液各5份，分別加入390 μL的此上清液，渦旋振蕩1 min，置于高速離心機中以13000 r·min-1離心10 min，取50 μL上清液，加入50 μL純水混勻，取5 μL進樣分析后獲得相應的峰面積B；取10 μL低、中、高3種濃度的工作液各5份，分別加入90 μL的純水配置成對照品溶液，并按照“2．2．4”項下方法處理，進樣分析后獲得相應的峰面積C。提取回收率為峰面積A與峰面積B之比，基質效應為峰面積B與峰面積C之比：血漿樣本的提取回收率為（47．06±6．34）%，基質效應為（52．47± 5．51）%，其他結果見表2。

2.2.9 穩定性考察按照“2．2．4”項下方法處理質控樣本，每一濃度5份進樣分析，考察了血漿樣本經歷3次冷凍-解凍循環穩定性、-40℃冷凍放置20 d穩定性、室溫放置6 h穩定性以及處理后室溫放置24 h穩定性，其中血漿樣品經歷3次冰凍-解凍循環后萬古霉素低、中、高3種濃度的RSD分別為9．03%、4．17%、1．52%；血漿樣品在-40℃放置20 d后處理測定萬古霉素低、中、高3種濃度的RSD分別為11．38%、5．40%、4．54%；血漿樣品室溫放置6 h后處理測定萬古霉素血漿樣品低、中、高3種濃度的RSD分別為8．64%、5．83%、7．39%；處理后置于進樣器24 h后，用當日處理的標準曲線計算萬古霉素低、中、高3種濃度的RSD分別為13．32%、5．51%、2．41%。結果表明，在上述穩定性考察條件下，萬古霉素均保持穩定，未出現明顯變化。符合生物樣品分析要求。

3 樣本檢測結果與比較

分別采用HPLC法、LC-MS/MS法和FPIA法檢測95份臨床使用萬古霉素進行血藥濃度監測的樣本，并采用SPSS 11．5軟件對測定結果進行相關性分析和偏倚分析，發現HPLC法和LC-MS/MS法分別與FPIA法測定結果具有顯著相關性，r=0．9621，P＜0．0001和r=0．9466，P＜0．0001（見圖3），Bland-Altman偏倚分析發現只有95%的樣本都在Mean± 1．96SD范圍內，所以認為HPLC法和LC-MS/MS法與FPIA法的偏倚不顯著。

圖3 HPLC法、LC-MS/MS法與FPIA法測定萬古霉素血藥濃度的相關性（n=95）

4 討論

目前對萬古霉素進行常規血藥濃度監測，應用最多的方法是FPIA法，具有較為快速、經濟、結果準確的特點；但是基于免疫學原理的眾多監測方法其共同缺點是易受到其它藥物或代謝物的干擾，若商品化的試劑盒的供應不及時可能影響臨床的監測，同時專用的檢測設備及每個監測品種的專用試劑盒也不夠靈活?；谏V的方法具有特異性好、使用靈活的特點：其中HPLC法使用尤其廣泛，但也有操作繁瑣、分析時間長、靈敏度達不到要求的缺點；LC-MS/MS法具有靈敏、快速、簡便、準確的優勢，已有很多實驗室用于基礎研究和臨床研究，但儀器昂貴，基質效應大。3種方法各有優劣，我們分別采用3種方法檢測了95例萬古霉素血藥濃度，兩種方法與FPIA法較為一致，經Passing-Bablok分析，分別僅有5個標本偏差＞1．96 SD，不存在顯著偏倚。

萬古霉素和去甲萬古霉素均為雙電荷母離子[M＋2H]2＋，因此選擇m/z 725．0→144．0和718．5→144．0作為定量離子對。萬古霉素屬于水溶性分子，所以本文建立的HPLC和LC-MS/MS測定法均采用耗時較短的蛋白沉淀法處理血漿樣品。目前，酸、鹽、有機溶劑等都可用作沉淀劑，其中強酸高氯酸，可在較少用量時較為完全地沉淀血漿，從而較少地稀釋樣本，適用于靈敏度較低的HPLC法。而乙腈的沉淀效率高，能夠完全沉淀蛋白并對殘余雜質起稀釋作用，所以適用于靈敏度較高的LC-MS/MS法，整個處理過程中8倍稀釋工作液后的最低檢測限仍然達到0．4 μg·mL-1，可以滿足人體藥物代謝動力學研究的要求。但兩種方法的提取回收率均不高，且LC-MS/MS法存在較強的基質效應，在其他文獻[4]中也存在此現象。推測原因可能是萬古霉素在沉淀劑中的低溶解度導致沉淀過程中產生較大損耗，特別是有機溶劑（乙腈）能更大程度地降低萬古霉素的溶解度，進而降低其回收率[10]。徐冰等用HPLC法測定血漿中萬古霉素濃度時的提取回收率為68%～72%[6]，焦志鐵等用HPLC法測定血漿中去甲萬古霉素濃度時的提取回收率為53%～57%[11]，冼燕萍等建立的UPLC-MS/MS法測定豬肉中萬古霉素與去甲萬古霉素時認為其方法存在較大的基質效應[4]。雖然采用液液萃取和固相萃取[12]等多種手段聯合的方法可將提取回收率提高至70%以上，并一定程度上降低基質效應[5]，但卻大大延長了樣品處理時間。因此考慮多次測定同一批樣本結果未出現較大波動，及與FPIA法測定結果具有較強的相關性和較小偏倚，本研究仍然采用沉淀法處理血漿樣品，確保測定方法準確而快速。

本文建立了HPLC法和LC-MS/MS法用于監測血漿中萬古霉素血藥濃度，方法與FPIA法結果一致，均可替代FPIA法進行萬古霉素的血藥濃度監測及人體藥物代謝動力學的研究。

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Establishment of Chromatographic Methods for the Determination of Vancomycin in Human Serum

JIANG Hui-ting,CHEN Bing,YANG Wan-hua*
Department of Pharmacy,Ruijin Hospital,Shanghai JiaoTong University School of Medicine,Shanghai 200025,China

Objective：To establish an HPLC and LC-MS/MS method for determining vancomycin in humanserumandtocomparewithFPIA．Methods：SerumsamplesforHPLCwereextractedby sedimentation with 10%perchloric acid．The chromatographic column of NovaPak C18was used and the column temperature was kept at 35℃．The mobile phase was composed of KH2PO4buffer solution-methanol (85∶15,v/v,pH=3．2),the flow rate was 1 mL·min-1and the UV detection was performed at 230 nm．Serum samples for LC-MS/MS were precipitated by acetonitrile and the supernatants were used．The separations were performed on an Agilent Eclipse XDB-C18analytical column(100 mm×2．1 mm,3．5 μm)at 40℃with the mobile phase composed of water(0．1%formic acid)-acetonitrile(90∶10,v/v)at a flow rate of 0．2 mL· min-1．ESI was used which was performed in the multiple reaction monitoring mode(MRM)using target ionsm/z725．0→144．0(vancomycin)andm/z718．5→144．0(IS)．Then the HPLC and LC-MS/MS methods were used to determine 95 clinical samples comparing with FPIA．Results：The linear range of the two methods were 0．4～96 and 1．2～96 μg·mL-1,respectively,with LLOQ at 0．4 and 1．2 μg·mL-1．The intra-and inter-day RSD were within 15%．The HPLC and LC-MS/MS methods strongly correlated with FPIA without significantdifferences．Conclusion：TheHPLCandLC-MS/MSmethodsweestablishedwererapid, sensitive,precise and reliable for the determination of vancomycin in human serum,which can be applied in the study of human vancomycin pharmacokinetics and the practice of therapeutic drug monitoring．

Vancomycin;HPLC;LC-MS/MS;FPIA

R969.1

A

1673-7806（2014）06-509-05

姜慧婷，女，碩士研究生 E-mail:jianghuiting0227@163.com

*通訊作者 楊婉花，女，主任藥師，碩士生導師 E-mail:yangwanhuaxy@163.com

2014-04-10

2014-06-16