三葉半夏凝集素C端結構域的可溶表達及其活性研究

許韶威，劉冰穎，周 煒，高 永，楊支力，呂正兵，徐 濤

（浙江理工大學a.生命科學學院生物工程研究所；b.啟新學院；c.生命科學學院生物化學研究所，杭州310018）

三葉半夏凝集素C端結構域的可溶表達及其活性研究

許韶威a，劉冰穎b，周 煒a，高 永a，楊支力a，呂正兵c，徐 濤b

（浙江理工大學a.生命科學學院生物工程研究所；b.啟新學院；c.生命科學學院生物化學研究所，杭州310018）

利用pFT-32-SUMO表達載體在大腸桿菌中可溶表達三葉半夏凝集素C端結構域（P-D2），并研究其凝血活性、糖結合特異性以及腫瘤抑制活性。實驗結果表明，P-D2蛋白的產量為5 mg/L。該蛋白具有凝集小鼠紅細胞的活性，可以被D-甘露聚糖抑制，但不能被D-乳糖、D-葡萄糖、D-麥芽糖抑制。P-D2蛋白的體外抗腫瘤活性實驗表明其對肝癌細胞Bel-7404以及結腸癌細胞SW-620都有良好的抑制作用。凋亡現象觀察實驗發現P-D2蛋白可以誘導癌細胞Bel-7404的凋亡。這是首次在大腸桿菌表達系統中表達了可溶的半夏凝集素C端結構域，為其他凝集素的可溶表達提供了新的選擇。

P-D2；凝血活性；SUMO；Hochest染色；抗腫瘤活性

0 引 言

凝集素是一類廣泛存在于動植物中，可以特異性結合糖基的非免疫來源的糖蛋白或者蛋白［1-3］。凝集素這種糖結合特異性的能力，不僅賦予了凝集素凝血［1］、抗腫瘤［3］、殺蟲等生理特性，也使得其在現代生物研究中有很多的應用。如探索癌變過程中癌細胞表面的糖蛋白變化［4］，或者與一些生物素、熒光素、納米顆粒等結合，可用于電鏡或光鏡水平的免疫細胞學研究［5］等。半夏凝集素（PTA）是從中藥半夏塊莖中分離得到的一種活性蛋白［6］，可以凝集兔血細胞、鼠血細胞，但不能凝集人血細胞［7］，對多種腫瘤細胞如卵巢癌、結腸癌、肝癌等都有比較好的抑制效果，是一類發展前景比較好的潛在抗腫瘤藥物。在以往的凝集素表達研究中，研究者選用了原核表達系統以及家蠶桿狀病毒表達系統成功地表達了半夏凝集素［2，8］，但仍存在表達產物為包涵體、純化不易、表達周期過長、不適宜工業化生產等問題。

SUMO（small ubiquitin related modifier，小泛素相關修飾物）是一類廣泛的存在各種真核細胞中的小分子泛素樣修飾蛋白，在調節如RNA轉錄、蛋白的核質運輸等多種生理活動中起著重要作用［9］。有報道指出，一些難表達的蛋白可通過使用SUMO融合表達系統成功地表達［10］。SUMO能增加重組蛋白溶解性，促進其正確折疊［11］，且SUMO蛋白酶可以高效無損切開融合蛋白，并不影響表達的蛋白的活性。這使得SUMO融合表達系統在蛋白表達領域應用越來越廣泛。

半夏凝集素是由兩個相同的N端結構域和兩個相同的C端結構域組成的同源二聚體［7］。本研究首次采用人源SUMO融合表達系統成功地表達了可溶的三葉半夏凝集素C端結構域（P-D2）。這是首次表達獲得了可溶的三葉半夏凝集素C端結構域。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

PCR所需的試劑（Taq聚合酶、MgCl2、10× buffer、DNTP）、SanPrep柱式系列試劑盒（PCR產物純化試劑盒、膠回收試劑盒、小量質粒提取試劑盒）、限制性內切酶（Bam HⅠ和NotⅠ）、IPTG、酵母提取物、蛋白胨、SDS-PAGF所需試劑、Ni-NTA Sefinose TM Resin等均購自上海生工。p Fasy T1-pta質粒存儲于浙江理工大學生物工程研究所。質粒p FT-32-SUMO以及SUMO蛋白酶由浙江理工大學生物化學研究所王濤惠贈。其他所需未提及的試劑和耗材均購自杭州蘭堡生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 融合蛋白表達載體p FT-32-SUMO-D2的

構建與鑒定

以質粒p Fasy T1-pta（由本實驗室構建，半夏凝集素的序列保存于內）為模版，以P1、P2（表1）為引物，進行PCR擴增反應。擴增產物經凝膠電泳鑒定無誤后，割膠回收?；厥债a物以及質粒p FT-32-SUMO分別用Bam HⅠ和NotⅠ進行雙酶切，同樣經凝膠電泳鑒定無誤后，割膠回收酶切片段，進行連接。將連接產物轉化到DH5α感受態細胞中，挑取陽性克隆進行測序。

表1 三葉半夏凝集C端結構域基因序列引物序列

1.2.2 SUMO-D2融合蛋白的表達以及純化

將測序正確的重組質粒p FT-32-SUMO-D2轉化至表達菌株BL21（DF3），挑選陽性克隆進行誘導培養。以1%（V/V）的接種量接種到含氨芐青霉素（100μg/mL）LB培養基中，37℃培養6 h后，以1∶1 000（V/V）添加誘導劑IPTG，繼續誘導培養，誘導溫度為28℃，12 h后分別取誘導以及未誘導菌體進行超聲破碎，離心取上清過鎳柱純化。

1.2.3 SUMO-D2融合蛋白的酶切以及純化

利用SUMO蛋白上有His標簽，而目標蛋白上沒有標簽，因此可以通過鎳柱進行分離純化。收集得到的融合蛋白經BCA測定濃度后，加入適量的SUMO蛋白酶（按0.1%的m/m加入）?；靹蚝?，加入到透析袋中，4℃過夜透析，透析緩沖液為PBS。透析完畢后，取透析袋里的液體進行Ni-NTA柱親和層析，直接收集上樣后的流出液。流出液用超濾管進行濃縮，濃縮到目標濃度后，-80℃凍存直至使用。

1.2.4 P-D2蛋白凝血活性實驗以及糖結合特異性實驗

凝血活性實驗參照Luo［12］所示的方法。終濃度為2、4、6、8、10μg/mL P-D2蛋白溶液分別與適量的準備好的小鼠紅細胞混勻，靜置1 h后，在倒置顯微鏡下觀察實驗結果。對照組則加入等量的PBS。

糖結合特異性實驗參照Zhou［7］所示的方法。選用的糖類為D-甘露聚糖、D-乳糖、D-葡萄糖、D-麥芽糖。

1.2.5 P-D2蛋白的體外抗腫瘤活性

體外抗腫瘤活性實驗參照黃越［13］所示的方法。采用MTT法，選用的腫瘤細胞系為Bel-7404和SW-620。采用梯度稀釋在超凈臺內獲得一系列無菌梯度濃度的P-D2溶液，濃度分別為800、400、200、100、50μg/mL，稀釋的Buffer（50 mM NaCl，50 mM Tris）同樣過濾除菌。收集對數期細胞，每孔加入80μL細胞。接著5%CO2，37℃孵育。至細胞單層鋪滿孔底，每孔加20μL加入P-D2蛋白溶液，5個梯度，5個復孔。接著孵育48 h，倒置顯微鏡下觀察細胞狀態。之后每孔加入20μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續培養4 h。小心去掉培養液，小心吸去孔內培養液，倒扣晾干。每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀495 nm處測量各孔的吸光值（OD495）。

1.2.6 Hochest 33342染色觀察腫瘤細胞凋亡現象

腫瘤細胞凋亡現象觀察實驗參照Zhou［7］所示的方法。選用肝癌細胞為Bel-7404，熒光染料為Hochest 33342。經P-D2蛋白處理過的細胞培養液，每孔加入1μL Hochest 33342溶液（1 mg/ mL），繼續培養1 h。去掉培養液后，在倒置熒光顯微鏡下，觀察結果并拍照。

2 結果與討論

2.1 SUMO-D2融合蛋白表達以及分離純化

融合蛋白N端帶有6×His標簽用于鎳柱純化。純化圖如圖1所示。箭頭所指的即為SUMOD2融合蛋白。所有樣品都是超聲破碎后離心所得。圖1中箭頭所指的就是SUMO-D2蛋白，大小為32 kD。從圖中可得，該純化步驟所得的SUMO-D2的純度在95%以上。

圖1 SUMO-D2融合蛋白鎳柱純化

2.2 SUMO-D2融合蛋白酶切以及P-D2分離純化

因為SUMO蛋白N端帶有His標簽，而P-D2沒有帶His標簽，故上樣過鎳柱時，SUMO蛋白以及未被切開的SUMO-D2融合蛋白都會結合在柱子上，而P-D2則可以順利地流下來，收集上樣流下液即可以獲得P-D2蛋白，最后純化得到的P-D2蛋白產量為5 mg/L。盡管SUMO分子質量只有10 kD，但在SDS-PAGF電泳時大小為20 kD左右［14-15］。這與圖2中孔道2箭頭所示的相符。P-D2蛋白大小為12 kD左右，也與圖中箭頭指出的相符。

圖2 P-D2蛋白鎳柱純化

2.3 蛋白凝血活性實驗以及糖結合特異性實驗

過濾除菌的P-D2蛋白經梯度稀釋法稀釋出一系列濃度梯度，加樣到預先準備在96孔板中的血細胞中，倒置顯微鏡下觀察實驗結果，從而獲得最小凝集血細胞的濃度，如圖3所示。圖3A為對照組（PBS處理），B為實驗組（6μg/m L P-D2處理）。實驗結果表明，當P-D2的濃度降到6μg/mL時，可以觀察到一定的凝集效果。

糖結合特異性實驗是建立在凝血實驗基礎上的。當凝集素和特定的一些單糖或者多糖結合后，就觀察不到凝血現象。實驗結果表明，P-D2蛋白可以和D-甘露聚糖結合反應，觀察到最低的結合濃度為（0.63±0.05）mM/L，而D-乳糖、D-葡萄糖、D-麥芽糖濃度增加到300 m M/L也能觀察到血凝現象，說明D-乳糖、D-葡萄糖、D-麥芽糖不和P-D2反應。

2.4 P-D2蛋白體外抗腫瘤活性實驗

體外抗腫瘤活性實驗中，P-D2蛋白的終濃度呈遞增梯度（10、20、40、80、160μg/mL），處理時間為48 h，未加樣處理過的癌細胞被設置為對照，即為存活100%的。結果顯示（圖4），P-D2對這兩種細胞都表現出良好的抑制其增殖的效果，對兩者的抑制趨勢也是相同的。存活曲線同樣也表明P-D2對這種兩種癌細胞的抑制效果具有濃度依賴性，即在一定濃度范圍內，隨著加樣濃度的增加，抑制效果也同樣增加。其中P-D2蛋白對肝癌Bel-7404的抑制效果明顯優于對結腸癌SW620（P＜0.05）。

圖4 P-D2蛋白體外抗腫瘤活性實驗

2.5 Hochest 33342染色觀察腫瘤細胞凋亡現象

P-D2蛋白的終濃度呈遞增梯度（10、20、40、80、160μg/mL），處理時間為24 h和48 h，對照組PBS處理。加樣處理48 h后，在加熒光染料觀察前，倒置顯微鏡觀察細胞狀態，結果（圖5）顯示，P-D2蛋白處理過的細胞，出現明顯的變圓收縮，且隨著蛋白濃度的增加，作用效果更明顯。這表明了P-D2蛋白對肝癌細胞Bel-7404的抑制效果具有濃度依賴性。

圖5 Bel-7404細胞形態學的改變

典型的凋亡特征是形態學上出現染色質聚集，呈月牙狀，細胞皺縮，胞漿致密，直至出現凋亡小體。從形態學上看，Hochest 33342染色下，正常的細胞淡藍色呈圓形，內有較深的藍色顆粒。而凋亡的細胞呈現亮藍色，或者核呈分葉狀、邊集、碎片狀。如圖6所示，處理時間為24 h的細胞，大多數剛開始出現凋亡，即處在凋亡早期。隨濃度升高，部分細胞呈現凋亡中后期的特征。處理時間為48 h的細胞，在較低濃度下，部分細胞呈現凋亡中后期的特征，隨濃度升高，處在凋亡晚期的細胞也越多，同時細胞密度也越低。而對照組正常，說明了P-D2誘導了Bel-7404細胞的凋亡。

圖6 Bel-7404細胞核染實驗

2.6 討論

盡管已經從植物、無脊椎動物中提取了成千上百種的凝集素，用于研究其生物學上的性狀或者生物學上的應用［3，16］，但很少有研究凝集素的工程菌表達。潛在的原因是，凝集素的表達仍是一個難點或者天然的凝集素獲取更加經濟、簡便。孫素榮等［7］的研究就發現優化后的新疆黃精凝集素序列才能在酵母表達系統內表達。半夏凝集素作為甘露聚糖凝集素家族的一份子，對眾多的腫瘤細胞有較好的抑制增殖的作用以及在研究甘露聚糖受體有一定貢獻。迄今為止，半夏凝集素已經在原核表達系統以及家蠶桿狀病毒表達系統里成功表達出來［2，8］，但仍存在表達后是包涵體或者是表達周期過長、純化不易等諸多難以解決的問題。本研究首次利用SUMO融合系統成功地表達了可溶的半夏凝集素C端結構域蛋白，即P-D2蛋白，解決了以往半夏凝集素表達不可溶的問題。

凝血特性是凝集素蛋白的本質特性。不同的凝集素所能凝結的紅細胞類型也不一樣。而能凝集人紅細胞的凝集素相對更少，將近十分之一的豆科凝集素可以專一地凝集人的某一種紅細胞。利馬豆和野豌豆的簇絨的提取物，只能凝集人A型紅細胞，而不能凝集B型或者O型的。豆科灌木植物加納谷物的提取物，更專一的凝集B型。凝集素之所以可以凝集紅細胞，是因為凝集素可以和細胞表面的一些糖蛋白發生特異性的結合。這也使得凝集素不僅僅可以凝集紅細胞，對淋巴細胞、某些細菌以及真菌同樣有沉降效果［1］。半夏凝集素對兔血，小鼠血都有比較好的凝集效果，但對人血沒有凝集效果。在P-D2蛋白凝血活性研究中，P-D2蛋白在較低的濃度（6μg/mL）對小鼠紅細胞表現出較強的凝集效果。凝集素這種糖結合特異性的特點，在P-D2蛋白糖結合特異性實驗中也得到體現。P-D2蛋白可以和D-甘露聚糖發生結合反應，觀察到最低的結合濃度為（0.63±0.05）mM/L，而D-乳糖、D-葡萄糖、D-麥芽糖未能發生結合反應。

大量研究表明凝集素對各類腫瘤細胞都有較好的抗腫瘤活性［18］。其原因在于凝集素可以特異性地結合某些癌癥細胞表面的糖類，干擾其正常生長。這使得同種凝集對不同的腫瘤細胞作用效果也不同。P-D2蛋白抗腫瘤活性實驗中表明，P-D2蛋白對著Bel-7404以及SW620這兩種癌細胞都表現出良好的抑制其增殖的效果，其抑制效果具有濃度依賴性。但對Bel-7404癌細胞的作用效果優于SW620細胞。其原因是這兩種癌細胞表面的糖蛋白種類不同，而P-D2蛋白抑制腫瘤細胞增殖的原因可能是其與癌細胞表面的糖蛋白發生反應，從而中斷癌細胞增殖的某些信號通路。核染實驗中發現，P-D2蛋白可以引起Bel-7404細胞的凋亡。凋亡程度呈現時間依賴和濃度依賴。目前的研究表明凝集素所引起的凋亡機制可分為兩種，一種是當凝集素與細胞膜上的受體結合后，可激活caspase途徑，如蒙大拿鐵線蓮凝集素可激活caspase途徑，從而誘導HepG2和HeLa等腫瘤細胞發生凋亡［19］，另一種是通過內吞作用激活線粒體途徑從而誘發凋亡［5］，如伴刀豆凝集素可促進小鼠巨噬細胞（PU5-1.8）中的線粒體的聚集和細胞色素C的釋放從而誘導凋亡［19］。但半夏凝集素引發凋亡的機制尚未得到研究，其引發凋亡的分子機制需要進一步的研究才能確定。

3 結 論

采用SUMO融合表達系統成功地表達了可溶并有活性的三葉半夏凝集素C端結構域，即P-D2蛋白。P-D2蛋白產量為5 mg/L。凝血活性實驗表明P-D2的濃度降到6μg/mL時，可以觀察到明顯的凝集效果。糖結合特異性實驗表明P-D2蛋白可以和D-甘露聚糖結合反應，觀察到最低的結合濃度為（0.63±0.05）mM/L，而D-乳糖、D-葡萄糖、D-麥芽糖濃度增加到300 m M/L也不能發生結合反應。P-D2蛋白對Bel-7404以及SW620這兩種癌細胞都表現出良好的抑制其增殖的效果，其抑制效果具有濃度依賴性。核染實驗中發現，P-D2蛋白可以引起Bel-7404細胞的凋亡，凋亡程度隨蛋白作用時間和濃度的增加而增加。

［1］Rudiger H，Gabius H J.Plant lectins：occurrence，biochemistry，functions and applications［J］.Glycoconjugate Journal，2001，18（8）：589-613.

［2］Xu T，Wang B，Wang L，et al.Pinellia ternata aggluti

nin produced in Bombyx mori cells exhibits bioactivity

［J］.Acta Biochimica Polonica，2012，59（2）：231-236.［3］Liu B，Bian H J，Bao J K.Plant lectins：potential antineoplastic drugs from bench to clinic［J］.Cancer Letters，2010，287（1）：1-12.

［4］Sharon N，Lis H.History of lectins：from hemagglutinins to biological recognition molecules［J］.Glycobiology，2004，14（11）：53R-62R.

［5］鮑錦庫.植物凝集素的功能［J］.生命科學，2011，23（6）：533-340.

［6］Liu X，Tian X，Liu T，et al.Disclosure of the tuberous lectin composed of homogeneous tetramers in pinellia pedatisecda schott［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，162（4）：1214-1223.

［7］Zhou W，Huang Y，Xu S，et al.Prokaryotic expression and bioactivity analysis of N-terminus domain of PineLLia ternata agglutinin using alkaline phosphatase signal peptide［J］.Protein Fxpression and Purification，2013，89（1）：84-91.

［8］Lin L，Lu J，Zeng H，et al.Molecular cloning and characterization of a mannose-binding lectin gene from Pinellia cordata［J］.Molecular Biology Reports，2008，35（4）：641-647.

［9］姜媛媛，尹成凱，李晉南，等.利用SUMO融合系統高效表達可溶性重組蛋白的研究［J］.東北農業大學學報，2008，39（10）：57-62.

［10］Kawabe Y-i，Seki M，Seki T，et al.Covalent modification of the Werner's syndrome gene product with the ubiquitin-related protein，SUMO-1［J］.Journal of Biological Chemistry，2000，275（28）：20963-2096.

［11］侯玉婷，李晉南，任桂萍，等.人FGF-21基因的克隆表達及其調節脂肪細胞糖代謝的活性 ［J］.遺傳，2010，32（6）：583-587.

［12］Luo Y，Xu X，Liu J，et al.A novel mannose-bindingtuber lectin from Typhonium divaricatum（L.）Decne（family Araceae）with antiviral activity against HSV-II and anti-proliferative effect on human cancer cell lines［J］.Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2007，40（3）：358-367.

［13］黃 越，陳文鐸，周 煒，等.復制缺陷型腺病毒PCA的構建及其對結腸癌細胞生長的影響［J］.浙江理工大學學報，2013，30（6）：901-905.

［14］Zuo X，Li S，Hall J，et al.Fnhanced expression and purification of membrane proteins by SUMO usion in Fscherichia coli［J］.Journal of Structural and Functional Genomics，2005，6（2-3）：103-111.

［15］Butt T R，Fdavettal S C，Hall J P，et al.SUMO fusion technology for difficult-to-express proteins［J］. Protein Fxpression and Purification，2005，43（1）：1-9.

［16］張利芬，白素芬，李 欣.煙夜蛾血淋巴凝集素活性的研究［J］.河南農業大學學報，2013，47（3）：313-317.

［17］孫素榮，張 智，李素麗，等.新疆黃精凝集素基因的克隆序列分析和表達［J］.生物工程學報，2008，24（3）：387-394.

［18］Valentiner U，Fabian S，Schumacher U，et al.The influence of dietary lectins on the cell proliferation of human breast cancer cell lines in vitro［J］.Anticancer Research，2003，23（2B）：1197-1206.

［19］Peng H，Lv H，Wang Y，et al.CLematismontana lectin，a novel mannose-binding lectin from traditional Chinese medicine with antiviral and apoptosis-inducing activities［J］.Peptides，2009，30（10）：1805-1815.

Study on SoIubIe Expression and Bioactivity of C-Terminus Domain of PineIIia Ternata AggIutinin

XUShao-weia，LIU Bing-yingb，ZHOU Weia，GAOYonga，YANG Zhi-Lia，LüZheng-bingc，XU Taoa
（a.Biological Fngineering Research Institute，b.Qixin College，c.Biological Chemistry Research Institute，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

p FT-32-SUMO expression vector was used for soluble expression of C-terminus domain of pinellia ternata agglutinin（P-D2）and study on hemagglutination activity，saccharides binding specificity and tumor-inhibition activity.The results show that，the output of P-D2 protein is 5 mg/L.This protein has the activity to agglutinate erythrocyte of the mice and can be inhibited by D-mannan but not by D-lactose，D-glucose and D-maltose.The experiment of antitumor activity in vitro of P-D2 protein indicates it has good inhibiting effect on hepatoma carcinoma cell Bel-7404 and colon cancer cell SW-620.It is found through observation of apoptosis phenomenon that P-D2 can induce apoptosis of Bel-7404.Soluble C-terminus domain of pinellia ternata agglutinin is expressed in escherichia coli expression system the first time. This provides new choice for soluble expression of other agglutinin.

P-D2；hemagglutination activity；SUMO；hochest dyeing；antitumor activity

Q816

A

（責任編輯：許惠兒）

1673-3851（2014）04-0439-06

2013-12-17

國家自然科學基金資助項目（30772712），大學生創新項目（201310338122）

許韶威（1988-），男，浙江衢州人，碩士研究生，研究方向為天然藥物化學。

徐 濤，電子郵箱：pkuxt@aliyun.com