響應面法優化重組畢赤酵母表達纖維素酶EG27的研究

耿新偉，孫亦靈，張柏超，蔣 磊，陳 瑋，趙輔昆

（浙江理工大學生命科學學院，杭州310018）

響應面法優化重組畢赤酵母表達纖維素酶EG27的研究

耿新偉，孫亦靈，張柏超，蔣 磊，陳 瑋，趙輔昆

（浙江理工大學生命科學學院，杭州310018）

為優化重組畢赤酵母表達動物內源性纖維素酶FG27的培養基條件，在單因素實驗基礎上，以培養基中酵母粉、蛋白胨、葡萄糖的含量為自變量，FG27的酶活為響應值，采用Box-Behnken設計的方法，研究各自變量及其交互作用對畢赤酵母產FG27收率的影響。利用Design-Fxpert軟件和響應面分析相結合的方法對畢赤酵母產動物內源性纖維素酶FG27的培養基條件進行優化，確定了最佳的培養基條件。在該培養條件下，獲得最高產酶量為354 U/L。

纖維素酶；FG27；畢赤酵母；響應面

0 引 言

工業化的快速發展使得化石燃料被大量消耗，能源危機日趨嚴重，因此，開發新能源是人類可持續性發展所面臨的重要問題。纖維素是自然界中含量最豐富的可再生資源之一［1］，全世界植物每年通過光合作用產生超過1013t纖維素物質［2-5］。這些多糖類物質可為人類提供巨大的能量來源。然而，這些材料需轉化成葡萄糖、木糖等單糖物質才能被有效利用。通過酸水解、堿水解、酶水解等一系列手段可降解纖維素形成簡單糖進而通過微生物發酵生產乙醇等能源物質［5］，其中酶法水解以其高效性與環保性是最具有應用前景的處理方法。但是纖維素酶較高的生產成本制約這一途徑的有效開展［6-7］，因此開發高比活的纖維素酶和提高纖維素酶的產量是解決這一問題的關鍵之一。

纖維素酶是一種復合酶系，包含了葡聚糖內切酶（endo-β-1，4-glucanase，endoglucanase，FG，FC 3.2.1.4，也被稱之為纖維素內切酶），葡聚糖外切酶（exo-β-1，4-glucanase，exocellulase，exoglucanase，cellobiohydrolase，CBH，FC3.2.9.11，也被稱之為纖維素外切酶）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，FC 3.2.1.21）［8］。本實驗室從福壽螺的胃液中分離到一種動物內源性的纖維素酶FG27，該酶具有內切-β-1，4-葡聚糖酶活性。其最適p H值為4.5～5.0之間，并且在p H 3.0～11.0的范圍內有很好的穩定性［9-11］。此外，該酶的最適反應溫度為55℃，并且有極高的熱穩定性。以上特性都預示著纖維素酶FG27可應用于食品、飼料、燃料乙醇生產等領域。

響應面分析（response surface analysis，簡稱RSA）指利用數學原理設計若干具有代表性的實驗，并通過這些實驗的結果，采用多元二次回歸方程來擬合因素和響應值之間的函數關系，然后通過對擬合的回歸方程進行分析來尋找各個因素的最優組合。Box-Behnken設計是一種常用的響應面設計法，在該設計中，每個因素取3個水平，分別用（-1，0，1）進行編碼，隨后按照設計的實驗表進行實驗，并擬合出各組實驗值與各個因素間所關聯的響應曲面。響應面分析法已成為一種解決實踐中多變量問題的優化方法而廣泛應用于食品、醫藥及生物領域［12-15］。

本文以前期構建的表達福壽螺內源性纖維素酶FG27的重組畢赤酵母為對象，通過響應曲面法實驗設計初步探索了重組畢赤酵母表達FG27的最佳培養條件，為大規模表達FG27提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

分泌表達福壽螺纖維素酶FG27的重組畢赤酵母pGAPZaA-FG27/SMD1168由本實驗室構建并保存。

1.1.2 試劑

酵母膏、蛋白胨購自Sigma公司；Zeocin購自Invitrogen公司；葡萄糖、氫氧化鈉、酒石酸鈉、3′5-二硝基水楊酸、亞硫酸氫鈉、山梨醇均為國產分析純。

YPD培養基：蛋白胨20 g/L、酵母膏10 g/L、葡萄糖20 g/L、Zeocin 25μg/mL。

1.1.3 儀器

SPX-250B-Z型生化培養箱（上海博迅實業有限公司）；752型分光光度計（上海第三儀器分析廠）；DHZ-D搖床（太倉市實驗設備廠）。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶培養

通過平板劃線法將重組酵母接種至YPD固體培養基平板，培養24 h，挑取單克隆接種至3 mL YPD培養基中培養12 h，接種至含50 mL發酵培養基的250 mL的錐形瓶中，搖床250 r/min，30℃，培養48 h。

1.2.2 FG27酶活的測定

20μL酶液加入180μL 1%（w/v）CMC（溶于100 mM p H4.8醋酸鈉緩沖液中）底物中，50℃水浴反應10 min，加入0.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min，立即置入冷水浴冷卻，加入0.5 mL雙蒸水，混勻后讀取520 nm處吸收光值，以滅活的酶液經相同測活方法作為空白對照組。FG27酶活力單位定義為在上述條件下，每分鐘水解生成1μmol葡萄糖還原當量所需的酶量為一個單位（U）［16］。

1.2.3 Box-Behnken組合實驗與響應面分析

對各因素采用Box-Behnken的中心組合原理設計實驗并進行響應面分析確定最佳培養基比例，每個因素取3個水平，以（-1，0，1）編碼實驗。本階段實驗設計、數據分析和模型建立均由Designexpert7.1.6軟件輔助完成。

2 結 果

2.1 畢赤酵母表達動物內源性纖維素酶FG27培

養條件的單因素實驗

培養基組分對微生物生長和產物生成有很大影響。不同菌種的最適培養基也不盡相同。為提高FG27的表達量，對其培養基進行優化研究。首先對酵母最基礎的3種培養基成分進行了單因素實驗，結果如圖1-圖3所示。

圖1 蛋白胨濃度對FG27表達量的影響

圖2 葡萄糖濃度與FG27表達量的影響

圖3 酵母膏濃度對FG27表達量的影響

蛋白胨、酵母膏和葡萄糖是酵母生長的最重要的培養基成分，為其提供了碳源，氮源，生物素等基本物質。實驗結果如圖1示，當蛋白胨濃度為3.5%時，FG27表達量達到最大，之后呈現下降趨勢。葡萄糖的影響如圖2示，當濃度介于2%～4%時，FG27的表達量達到最大，之后表達量下降。以上結果表明，葡萄糖和蛋白胨作為基本的碳源和氮源對重組FG27的表達均有明顯的影響，當兩者濃度過低時，FG27表達量較低，而當兩種組分濃度過高時又一定程度上抑制了表達量。此外，酵母膏對重組FG27的影響結果如圖3示，FG27的表達量隨酵母膏濃度的增加而緩慢增加，表明酵母膏對產酶也有一定影響。

2.2 Box-Behnken組合實驗與響應面分析

2.2.1 實驗設計

在單因素實驗的基礎上，采用Box-Behnken設計對蛋白胨、酵母膏和葡萄糖一步優化。每個因素取3個水平，各因素的水平如表1所示。按照設計的培養基進行發酵實驗。Box-Behnken試驗設計和試驗結果如表2所示。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平

表2 Box-Behnken設計與結果

由Design-Fxpert7.1.6軟件擬合得多項式回歸模型為：

回歸方程方差分析見表3，可信度分析見表4。由表3分析可以看出，模型是高度顯著的，模型復相關系數R2為98.54%，說明模型的相關度很好。變異系數（CV）反映模型的置信度，CV值越低模型的置信度越高，而本試驗的CV值為1.57%，說明模型方程能很好的反映真實的實驗值，因此該模型能很好的預測各因素對FG27產酶的影響。各因素間交互作用對酶活響應的影響曲面和等高線如圖4-6所示。

表3 回歸方程方差分析

表4 模型可信度分析

為了進一步研究相關變量之間的交互作用以及確定最優點，我們通過Design-Fxpert軟件繪制響應面曲線圖來進行可視化的分析（圖4-圖6）。從等高線圖可以直觀地反映出兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反，因此葡萄糖與蛋白胨的交互作用最為顯著。

由響應面立體圖可以看出，曲面均呈山丘形，即響應值存在最大值。進一步通過軟件分析計算，得到最大產量時的各因素濃度的編碼值：X1=0，X2= 0.03，X3=0.06，對應的實際濃度分別為，蛋白胨30 g/L，酵母膏60.9 g/L，葡萄糖30.9 g/L，得到模型預測的FG27最大產量為353.592 U/L，與實際測試值相符。

圖4 酵母粉和蛋白胨對酶活的響應面與等高線

圖5 葡萄糖和蛋白胨對酶活的響應面與等高線

圖6 酵母粉和葡萄糖對酶活的響應面與等高線

3 討 論

纖維素酶廣泛存在于微生物［17］、植物等體內。傳統觀點認為，動物自身不能產生纖維素酶，其對纖維素的水解主要是依靠消化道內共生菌和共生原生動物完成的。然而1997年Tokuda等［18］的研究卻打破了這一傳統觀點，他們從一種白蟻Nasutitermes takasagoensis的中分離純化到一種具有高比活力的β-1，4-內切糖苷酶，近年來相繼在線蟲［19］、貽貝［20］、螯蝦［21］和天牛［22］中發現了動物內源性纖維素酶的存在，且均具有較好的酶學性質，如本實驗室前期分離得到的來源于福壽螺的纖維素酶FG27，該酶具有很好的p H穩定性和溫度穩定性。然而，來源于高等生物的酶需經過復雜的蛋白質翻譯后加工過程，這使得動物內源性纖維素酶難以利用微生物重組表達，從而限制了其應用于工業生產。因此，通過真核生物酵母對其進行重組表達和利用微生物發酵是一種提高動物內源性纖維素酶產量，降低其生產成本的有效手段，重組酵母培養過程中的各個因素均會對最終產量產生影響，如蛋白胨、葡萄糖等物質一方面為生物體生長提供了基本的能源，另一方面也為目的蛋白的合成提供了原材料。然而由于滲透壓等原因，也使得各種培養基組分配比存在著一個最優的范圍，過高的濃度反而會抑制微生物的生長，培養過程優化需對產酶條件影響的各因素最佳化，使終產物產率最高。

本文以重組酵母生長中最重要的培養基組分蛋白胨，酵母膏，葡萄糖為研究對象，利用單因素實驗確定了各因素的最佳濃度范圍，在此基礎上，采用了Box-Behnken設計組合實驗研究對3種自變量的交互作用對畢赤酵母重組表達FG27的影響。由響應面分析實驗得出，3種組分對產酶均影響顯著，依據回歸分析確定發酵最佳條件為蛋白胨30 g/L，酵母膏60.9 g/L，葡萄糖30.9 g/L，在最佳條件下FG27最高可達354 U/L。這為進一步大規模發酵生產動物內源性纖維素酶FG27提供一定的參考。

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Study on Expression of CeIIuIase EG27 through Optimization and Recombination of Pichia Pastoris Based on Response Surface MethodoIogy

GEN Xin-wei，SUN Yi-Lin，ZHANGBo-chao，JIANG Lei，CHEN Wei，ZHAO Fu-kun
（School of Life Science，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

In order to optimize and recombine culture medium conditions in which pichia pastoris expresses animal endogenous cellulose FG27，on the basis of single factor experiment，the content of yeast powder，peptone and glucose in the culture medium served as independent variables and enzyme activity of FG27 served as the response value.Box-Behnken deisgn method was used to study the effects of each independent variable and their interactions on FG27 yield by pichia pastoris.Design-Fxpert software and response surface analysis were combined to optimize the culture medium conditions to confirm the best culture medium conditions.Under such conditions of culture，the highest enzyme yield was 354 U/L.

cellulase；FG27；pichia pastoris；response surface

Q786

A

（責任編輯：許惠兒）

1673-3851（2014）04-0456-06

2013-10-30

浙江省大學生科技創新項目（2013R406021）

耿新偉（1989-），男，河南安陽人，碩士研究生，主要從事分子生物學和微生物發酵的研究。

陳 瑋，電子郵箱：cw@zstu.edu.cn