金錢魚腦型芳香化酶基因cDNA的克隆及表達分析

張敏智,李廣麗,朱春華,鄧思平

(廣東海洋大學 水產學院 南海水產經濟動物增養殖廣東普通高校重點實驗室, 廣東 湛江,524088)

金錢魚(Scatophagus argue Linnaeus)又名金鼓魚,隸屬鱸形目 (Perciformes)金錢魚科(Scatophagidae),金錢魚屬(Scatophagus)。國際上金錢魚科僅金錢魚1屬 3 種,為廣鹽性亞熱帶魚類,廣泛分布于印度-太平洋水域[1],中國東南沿海及北部灣均有分布,其中在廣東、臺灣及廣西沿岸為常見的魚類。目前,金錢魚大部分養殖種苗仍然來自野生資源,數量有限且呈逐年減少之勢,市場對人工種苗的需求量逐漸增大。但人工繁育過程中金錢魚卵巢不能充分成熟,且雄性性成熟早于雌性[2],為人工繁殖金錢魚帶來困難。因此,人工誘導金錢魚卵巢發育是解決金錢魚大批量苗種生產的關鍵所在。

在大多數哺乳動物中,芳香化酶由 Cyp19單基因編碼,但在硬骨魚類中卻發現了兩種芳香化酶基因,即腦型芳香化酶(Cyp19a1b)和性腺型芳香化酶(Cyp19a1a),分別以明顯不同的形式存在于腦和性腺中[3-4]。研究表明,芳香化酶可影響哺乳動物中樞神經系統的發育和功能,調節神經內分泌和繁殖功能[5]。有報道指出[6]芳香化酶與性取向有關,若雌性先熟則芳香化酶的表達量減少,而雄性先熟則表達量增加。此外,芳香化酶的表達及其酶活性可受性類固醇激素和促性腺激素等的調控[7],也受到溫度等環境因素的控制和調節[8]。研究發現, 性類固醇激素(E2)先與芳香化酶神經樣細胞上的雌激素受體結合,而后激發芳香化酶基因的表達[9-10]。Carlos[11]證實,促性腺激素中卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)是調節芳香化酶活性的重要因子。FSH可誘導產生芳香化酶,而 LH通過增加胞內環磷酸腺苷(cAMP)濃度活化蛋白激酶 C(PKC),PKC的活化則會阻礙FSH誘導產生芳香化酶。溫度對魚類性腺發育成熟過程的效應則有以下幾點: (1)直接影響一些酶和激素的活性,進而影響性腺的發育;(2)影響性腺對促性腺激素(GtH)的敏感性;(3)影響腦垂體對 GtH的合成及分泌。在尖紋鱸(Lates calcarifer)[12]和半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)[13]等的研究中都表明高溫將抑制Cyp19a1b基因的表達。然而,迄今為止,有關魚油對芳香化酶Cyp19的影響,以及溫度和飼料中魚油含量對金錢魚卵巢發育相關基因的研究尚未見報道。

本研究采用 RT-PCR和 RACE法,克隆金錢魚Cyp19a1b的cDNA全長,并采用實時熒光定量PCR檢測了溫度和魚油處理后雌性金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達,旨在探討 Cyp19a1b基因表達與溫度及魚油添加量的相互關系,為金錢魚人工繁育奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

基因克隆所用金錢魚購自湛江市霞山水產品批發市場,為雌性性成熟個體;溫度和魚油處理實驗所用魚均購自于廣東省珠海市龍勝魚苗培育基地,為二齡雌性金錢魚(體質量: (316.3±70.3)g,體長:(21.4±2.0)cm),晝夜充氧,水體鹽度為 10±2,自然光照,每日傍晚投喂1次。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物

簡并引物P1和P2根據GenBank中已有魚類腦型芳香化酶Cyp19a1b保守序列設計;特異性引物P3和 P4根據獲得的 Cyp19a1b基因保守區片段設計,以檢測溫度和魚油對雌性金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA表達的影響;根據已知片段設計特異性引物BGSP1、NBGSP1和 BGSP2,其中 BGSP1、NBGSP1通過巢式PCR來擴增Cyp19a1b cDNA的5′末端,而BGSP2 用來擴增其 3′末端;β-actinF 和 β-actinR 作為內參引物擴增金錢魚的 β-actin基因,以校正Cyp19a1b mRNA的相對表達量,所有引物見表 1,均由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 金錢魚Cyp19a1b cDNA的擴增與克隆

取雌性金錢魚腦垂體,抽提總 RNA,實驗流程參照Trizol Reagent (Invitrogen)說明書操作。取2 μg總RNA按照M-MLV Reverse Transcriptase反轉錄試劑盒(Promega)合成cDNA第一鏈,以簡并引物(P1和P2)擴增金錢魚 Cyp19a1b 基因保守區片段。采用SMARTer RACE試劑盒(Clontech)克隆金錢魚Cyp19a1b cDNA 3′末端和5′末端序列,按照SMARTer RACE試劑盒說明操作進行擴增。PCR產物于 1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳,切下目的條帶,用DC3511瓊脂糖DNA膠回收試劑盒(Biomiga)純化PCR產物。再將純化的產物與載體pMD-19T按9︰1的比例進行連接反應。最后取連接產物 10 μL用于轉化到DH5α中,進而恒溫培養、陽性克隆以及測序,測序在上海生工生物工程公司完成。

1.2.3 序列分析與進化樹的構建

應用 DNAMAN 5.0將測序所得保守區片段序列、5′端序列及3′端序列進行拼接,并推導氨基酸序列。將獲得的 cDNA序列與 GenBank中已有魚類Cyp19a1 cDNA序列進行相似性檢索比對,應用CLUSTAL W將推導的氨基酸序列與GenBank中已有魚類的 Cyp19a1氨基酸序列進行同源性比較。采用SignalP4.1server(http: //www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)預測金錢魚Cyp19a1b蛋白序列的信號肽。利用 MEGA5.0鄰位相聯法(Neighbor-joining),重復1000次,gap處理為缺失,基于Cyp19a1氨基酸序列構建各物種系統進化樹。

表1 克隆金錢魚Cyp19a1b cDNA序列及檢測表達所用引物Tab.1 Primers used for cloning and expression analysis of Cyp19a1b in S.argus

1.2.4 溫度和魚油對金錢魚腦垂體中 Cyp19a1b mRNA表達的影響

溫度處理和魚油處理實驗均分為 3組,其中因金錢魚適宜生長溫度范圍為 20～28℃,故溫度處理實驗魚分別飼養在水溫為 23、26和 29℃(加熱棒控制)的塑料桶(500 L)中,各溫度組溫差范圍控制在±1℃(溫度計實時監測);魚油處理實驗魚飼養在(1 m×1 m×2 m)的網箱中,分別投喂含0、2%和6%魚油的海水魚配制飼料(根據海水魚配制飼料配方進行配制)。溫度處理(3周和6周)、魚油投喂處理(4周和8周)以及實驗前(0周)時,每組隨機取3尾魚腦垂體組織,分別抽提總RNA。取2 μg RNA進行反轉錄,合成cDNA 第一鏈。取反轉錄產物 0.8 μL,熒光實時定量PCR檢測Cyp19a1b mRNA的表達,實驗流程參照熒光實時定量PCR測定試劑盒(BioRad)操作說明進行。

1.3 數據分析

運用 2ΔCt法計算Cyp19a1b和β-actin在金錢魚腦垂體組織在溫度和魚油處理過程的表達量;采用SPSS 17.0統計軟件中單因素方差分析(ANOVA)對數據進行分析,當 P＜0.05時視為差異顯著;并采用Duncan’s方法進行多重比較分析,數據均以平均值±標準誤(± S.E.)表示。

2 結果與分析

2.1 金錢魚Cyp19a1b基因全長 cDNA克隆

通過3個有重疊部分的PCR片段拼接獲得金錢魚Cyp19a1b cDNA全長。其中中間片段以雌性金錢魚腦垂體中抽提的總 RNA為模板,利用 Cyp19a1b高度保守序列設計的簡并引物P1和P2進行擴增,得到大小為 464bp的預期片段;利用特異性引物BGSP2和BGSP1、NBGSP1進行SMART-RACE-PCR,分別獲得3′末端1249 bp及5′末端1187bp的預期條帶,拼接后得到金錢魚Cyp19a1b cDNA全長(登錄號:JX841314)。金錢魚Cyp19a1b cDNA 序列由2409個核苷酸組成,其開放閱讀框(ORF)包含 1506 bp,編碼 501個氨基酸,5′端非編碼區(5′-UTR)有 164bp,3′-UTR(不包括 poly(A))有 712 bp(圖 1),推測其蛋白質分子量為 56.697kDa。利用 SignalP對金錢魚Cyp19a1b蛋白序列序列在線搜索,尋找信號肽序列,發現該蛋白存在信號肽的概率極低,不存在信號肽酶切位點,是一種非分泌蛋白。

2.2 序列分析與進化樹的構建

金錢魚Cyp19a1b cDNA序列與GenBank中已有魚類 Cyp19a1 cDNA序列相似性檢索比對顯示,所獲得序列與魚類 Cyp19a1b cDNA序列的同源性為70%～87%,與Cyp19a1a同源性低于56%。氨基酸序列比對顯示,金錢魚 Cyp19a1b與黃錫鯛(Rhabdosargus sarba)和舌齒鱸(Dicentrarchus labrax)Cyp19a1b同源性較高,分別為86.2%、86.5%。與鯉魚(Cyprinus carpio)、稀有 鯽(Gobiocypris rarus)、斑馬魚(Danio rerio)、赤點石斑魚(Epinephelus akaara)、大黃魚(Larimichthys crocea)、南方大口鯰(S.meridionalis)和鯔魚(Mugil cephalus)Cyp19a1b 同源性為64.1%～84.4%,而與上述7種魚Cyp19a1a 同源性低于 63.5%。與本實驗室研究的胡子鲇(Clarias fuscus)Cyp19a1b同源性也達到了70.8%。此外,金錢魚Cyp19a1b與人和家鼠腦型芳香化酶的親緣關系最遠,分別僅為52%和50.8%的同源性。與其他脊椎動物芳香化酶相似,金錢魚Cyp19a1b也包含 I－螺旋區(I-helix region)、芳香化酶特異保守區Ⅱ(aromatase specific substrate binding region)和血紅素結合區Ⅲ(heme-binding region)(圖 2)。

摘錄Genebank中大黃魚Cyp19a1b(ACO350-42.1)、大黃魚 Cyp19a1a (ACO35041.1)、斑馬魚 Cyp19a1b(AAK00642.1)、斑馬魚 Cyp19a1a (AAG-12243.1)、鯉魚 Cyp19a1b (ACC95443.1)、鯉魚 Cyp19a1a(ACB13197.1)、赤點石斑魚 Cyp19a1b(A-AS58447.1)、赤點石斑魚Cyp19a1a (AAS58448.1)、稀有 鯽Cyp19a1b(ADB44882.1)、稀有 鯽 Cyp19a1a(ADB29065.1)、舌齒鱸 Cyp19a1b(AAM-95455.1)、黃錫鯛 Cyp19a-1b(ABC70868.1)、細棘海豬魚(Halichoeres tenuispinis)Cyp19a1a(AAR3704-8.1)和鯔魚 Cyp19a1a(AAW7-2732.1)、胡子鲇Cyp19a1b (AFB77217.1)、南方大口鲇Cyp19a1a (AAP83133.1)的氨基酸序列構建氨基酸進化樹,結果顯示: 所有魚類 Cyp19a1b聚為一類,而Cyp19a1a則聚為另一類。金錢魚Cyp19a1b與黃錫鯛 Cyp19a1b同處于 Cyp19a1b一支,與大黃魚、舌齒鱸和赤點石斑魚Cyp19a1b同處于Cyp19a1b一大支,均屬鱸形目不同亞目,而與斑馬魚、鯉魚、稀有 鯽和胡子鲇 Cyp19a1b處于不同級不同分支,表明金錢魚與黃錫鯛親緣關系最近,與鯉形目中斑馬魚、鯉魚、稀有鯽以及鲇形目的胡子鲇親緣關系最遠,分析結果與根據傳統形態學和生化特征分類的結果相一致(圖3)。

圖1 金錢魚Cyp19a1b全長cDNA序列及編碼的氨基酸序列Fig.1 cDNA sequence and predicted amino-acid sequences of Cyp19a1b in S.argus

圖2 金錢魚腦型芳香化酶與其他脊椎動物芳香化酶部分氨基酸序列的比較Fig.2 Alignment of S.argus Cyp19a1b partial amino acid sequence and those of other species

2.3 溫度對雌性金錢魚腦垂體中 Cyp19a1b mRNA表達的影響

隨處理時間的延長,26℃和29℃組金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達量都逐漸降低,但29℃組顯著低于26℃組(P＜0.05)。此外,23℃組表達量先減小后增加,且在 6周時顯著高于 26℃和 29℃組(P＜0.05),其表達量大約為26℃組2倍(圖4)。

2.4 魚油含量對雌性金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA表達的影響

隨著投喂時間的延長,3個魚油投喂組腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達量均逐漸降低,魚油對金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達量無顯著影響(P ＞0.05)(圖 5)。

3 討論

圖3 基于NJ法構建的金錢魚Cyp19a1b和其他魚類的Cyp19a1系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Cyp19a1b in S.argus and Cyp19a1 in other fish based on NJ method

圖4 溫度對雌性金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA表達的影響(n=3)Fig.4 Effects of temperature on pituitary Cyp19a1b mRNA expression in female S.argus (n=3)

圖5 魚油對雌性金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA表達的影響(n=3)Fig.5 Effects of fish oil on pituitary Cyp19a1b mRNA expression in female S.argus (n=3)

芳香化酶(Cyp19a1)研究的代表類群從文昌魚(Branchiostoma)到人,表明Cyp19a1是一個在進化上起源早于脊椎動物的保守基因[14]。目前,在魚類[15,16]、鳥類[17]、嚙齒動物[18]和哺乳動物[19]的Cyp19a1 cDNA都已成功被克隆。本研究從金錢魚腦垂體中成功克隆了腦型芳香化酶基因 Cyp19a1b,通過氨基酸序列的同源性及系統進化樹分析可知,金錢魚 Cyp19a1b與其他魚類的Cyp19a1b同源性較高且聚為一支,與其他魚類的性腺型芳香化酶基因 Cyp19a1a 同源性較低。因此,所獲得的金錢魚 Cyp19a1屬于魚類Cyp19a1b,與同為鱸形目的黃錫鯛同源性最高,親緣關系最近,與鯉形目(Cypriniformes)中斑馬魚、鯉魚、稀有 鯽以及鲇形目(Siluriformes)的胡子鲇親緣關系最遠,分析結果與根據傳統形態學和生化特征分類的結果相一致。

在真核生物中,芳香化酶作為 1種膜結合蛋白,決定其定位在線粒體上還是內膜系統中,主要依賴于 N端信號序列。本研究中,通過在線對金錢魚腦型芳香化酶信號肽進行預測分析發現,該蛋白存在信號肽的概率極低,不存在信號肽酶切位點,為非分泌型蛋白,可將其定位于線粒體內膜上。芳香化酶主要功能除了決定性別分化的方向外,對性腺發育也有顯著影響[5,20]。有報道指出,腦芳香化酶可能參與腦－腦垂體－性腺軸的繁殖生理活動[21]。

大量研究表明,Cyp19a1b在硬骨魚腦垂體中有較高的表達量,如胡子鲇[22]、虹鱒[23](Oncorhynchus mykisss)和歐洲舌齒鱸[24](Dicent rarchus labrax)等。因此,本研究采用實時熒光定量 PCR檢測溫度和魚油處理后Cyp19a1b mRNA在腦垂體的表達,進而探討溫度和魚油添加量與Cyp19a1b的關系。目前,關于溫度對性腺型芳香化酶的報道較多,而對腦型芳香化酶的報道較少。在半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)[13]和羅非魚(Oreochromis mossambicus)[25]的研究中都表明,溫度過高將會抑制 Cyp19a1b mRNA的表達。最新研究也表明,水溫高于 28℃時尖紋鱸 (Lates calcarifer)腦中的芳香化酶活性將逐漸降低,而血漿中的 E2含量卻逐漸升高[12],可能 E2增加反饋抑制了芳香化酶活性[26]。本研究發現,隨著處理時間的延長,水溫26℃和29℃組金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達量均逐漸降低,與本實驗室6周E2的研究結果呈負相關(E2結果另文發表),可能是 E2增加對其的反饋抑制效應所致。此外,本研究還發現,實驗結束(6周)時,29℃組金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA表達量顯著低于26℃組,表明高溫抑制金錢魚Cyp19a1b mRNA的表達,與前人研究結論一致;23℃組腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達量在3周急劇降低,但實驗結束時又上升,這種現象在卵巢發育的過程中不能用E2反饋調節抑制來說明,其中的調節機制還有待進一步研究。

魚油中因富含 n-3多不飽和脂肪酸(PUFA),尤其是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA),在全球水產飼料中被大規模利用。而 EPA和 DHA與雌二醇(E2)密切相關[27],因此,魚油對魚類特別是海水魚類的正常繁殖、生長和發育都起著非常重要的作用,是其生命過程中不可缺少的營養因子[28]。研究表明,魚油中的PUFA可以誘導E2的增加,從而促進虹鱒[29]和黑鱸(Dicentrarchus labrax L.)[30]卵巢的發育。而E2是在芳香化酶Cyp19的催化作用下才能合成,因此,魚油中的PUFA可能會促進芳香化酶Cyp19基因的表達。本研究實時熒光定量PCR結果顯示,隨著投喂時間的延長,3個魚油投喂組腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達量均逐漸降低,與本實驗室8周E2的研究結果呈負相關(E2結果另文發表),因此,可能亦是由于 E2增加對其的反饋抑制調節所致。與此同時,研究發現魚油含量對金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達雖無顯著影響,但 8周時,腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達量依次為: 對照組＞2%魚油組＞6%魚油組,與 E2關系相反,表明金錢魚腦垂體中 Cyp19a1b mRNA的表達量隨魚油含量的增加而逐漸降低;魚油可誘導 E2水平不斷積累,當E2水平增加到一定水平將可能反饋抑制調節金錢魚腦垂體中Cyp19a1b mRNA的表達。

綜上所述,隨著卵巢發育或魚油含量的提高,可降低雌性金錢魚腦垂體中 Cyp19a1b mRNA的表達,這種降低可能是 E2反饋調節所致;水溫高于26℃將抑制Cyp19a1b mRNA的表達。

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