乳腺癌中P53的表達與上皮-間質轉化的相關性及其臨床意義*

霍莉莉 李 慧 魏 楓 任秀寶

乳腺癌中P53的表達與上皮-間質轉化的相關性及其臨床意義*

霍莉莉 李 慧 魏 楓 任秀寶

目的：探討乳腺癌組織中P53的表達和上皮-間質轉化（EMT）的相互關系及其臨床意義。方法：免疫組織化學法檢測63例乳腺癌組織中P53、Twist、Snail、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和Fibronectin的表達情況，分析乳腺癌突變型P53蛋白表達與臨床病理特征，患者預后和EMT發生之間的關系。結果：P53、Twist和Snail的陽性率以及EMT的發生率分別為44.4%（28/ 63）、54.0%（34/63）、68.3%（43/63）和41.3%（26/63）。乳腺癌P53表達與組織學分級相關（P＜0.05），與其他臨床病理特征無關（P＞0.05）。P53與Twist、Snail的表達存在相關性，而Twist、Snail和EMT發生相關（P＜0.05）。多因素分析顯示，淋巴結轉移、P53和EMT是乳腺癌患者預后的獨立影響因素。結論：P53的表達與乳腺癌組織學分級和EMT的發生相關，是患者預后的獨立影響因素，可作為乳腺癌治療的重要靶點。

乳腺腫瘤 P53 上皮-間質轉化 預后 免疫組織化學

cer,and3Key Laboratory of Cancer Immunology and Biotherapy,Tianjin,Tianjin 300060,China

This work was supported by the Tianjin Municipal Application Foundation and Cutting-edge Technology Research Project(No.12JCYBJC16100)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發生發展是多基因改變和環境因素聯合作用的結果。其中，P53突變是常見的基因改變之一，研究發現突變型P53的表達與乳腺癌預后不良相關［1］。上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指具有極性的上皮細胞轉化成為間質細胞并獲得侵襲和遷移能力的過程，目前研究認為EMT是腫瘤細胞發生侵襲與轉移的重要機制［2-3］。本研究采用免疫組織化學法檢測P53和EMT標志物在人乳腺癌組織中的表達水平，探討P53和EMT之間的相互關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 患者資料 所有標本均取自天津醫科大學腫瘤醫院乳腺外科2003年7月至2007年7月手術切除的浸潤性乳腺癌組織共63例，經病理確診均為非特殊型浸潤性導管癌?；颊呔鶠榕?，年齡27～69歲，中位年齡49歲。手術前均未接受過抗癌治療（包括放療、化療及內分泌治療等）?；颊咝g后分期：Ⅰ期4例，ⅡA期24例，ⅡB期20例，ⅢA期7例，ⅢB期2例，ⅢC期5例，Ⅳ期1例。組織學分級：Ⅰ級3例，Ⅱ級42例，Ⅲ級18例。ER（+）14例，PR（+）12例，HER-2（+）39例。術后輔助化療、放療及內分泌治療。隨訪時間從手術切除時間開始到死亡或2013年3月。本研究取得受試者知情同意，符合倫理學標準。

1.1.2 主要試劑 P53鼠抗人單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。Twist兔抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，Snail兔抗人多克隆抗體購自英國Abcam公司。E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、Fibronectin鼠抗人單克隆抗體購自美國BD公司。EliVision plus檢測試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法檢測乳腺癌組織P53、Twist、Snail和EMT標志物的表達 標本經10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片，常規HE染色及免疫組織化學染色。石蠟切片常規脫蠟水化，P53抗體采用EDTA（pH8.0）、其他抗體采用檸檬酸鈉緩沖液熱抗原修復，3%H2O2室溫孵育20 min阻斷內源性過氧化物酶活性。滴加一抗，4℃孵育過夜。滴加增加劑，濕盒室溫孵育20 min。滴加酶標記的二抗，濕盒室溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木精對比染色。常規酒精梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。以PBS代替一抗行陰性對照。

西方國家的社會救助權建立在生存權之上，這也決定了社會救助權的構成要件相對簡單，即只要以自身能力無法維持最低生活標準的公民即可向國家申請社會救助。舉例而言，美國的社會救助可以分為特殊救助（SA）和一般救助（GA）兩類，但兩者均要求社會救助權的行使需具備符合貧困標準以及自身或家庭難以完成脫貧兩個要件[10]，相似的，日本的生活保護制度也對社會救助權設定了符合保護基準和家庭保護不能兩個要件。[11]122-126基于上文指出的我國社會救助權與西方國家在憲法基點上的不同，其要件構成也具有一定的差異性，而這種差異性也是在法律與政策的互動中得以呈現。

1.2.2 陽性結果判斷 1）P53陽性結果判斷：P53以細胞核出現棕黃色顆粒為陽性表達，陽性細胞數≥10%為陽性切片。2）Twist和Snail陽性結果判斷：半定量判斷免疫組織化學結果，光鏡下隨機觀察10個高倍鏡視野，每個視野計數100個腫瘤細胞。按著色程度評分：0分為無著色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；按陽性細胞所占比例評分：0分為＜10%，1分為10%～24%，2分為25%～49%，3分為≥50%。以兩者之和判定結果，0～2分為陰性，3～6分為陽性。3）EMT陽性結果判斷：E-Cadherin以細胞膜出現棕黃色顆粒為陽性表達，陽性細胞數＞50%為陽性切片；N-Cadherin以細胞膜和（或）細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性表達，陽性細胞數＞1%為陽性切片；Vimentin以細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性表達，陽性細胞數＞1%為陽性切片；Fibronectin以細胞膜出現棕黃色顆粒為陽性表達，陽性細胞數＞1%為陽性切片。其中E-Cadherin為上皮細胞標志物，N-Cadherin、Vimentin和Fibronectin為間質細胞標志物。上皮細胞標志物表達陰性或者任一間質細胞標志物表達陽性計為EMT陽性。

1.3 統計學方法

數據采用SPSS 18.0統計軟件進行Mann-Whitney U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗和χ2檢驗，采用偏相關分析和二元Logistic回歸分析進行相關性分析，運用單因素Kaplan-Meier生存分析和多因素Cox生存分析模型分析影響乳腺癌患者預后的相關因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 P53、Twist、Snail和EMT標志物的表達情況

P53的表達主要位于細胞核，在檢測的63例標本中有28例表達陽性，陽性表達率為44.4%。Twist主要定位于細胞質，少數細胞核中亦有表達，陽性表達率為54.0%（34/63）。Snail定位于細胞核，陽性表達率為68.3%（43/63）。E-Cadherin表達于細胞膜和細胞質，其陽性表達率為74.6%（47/63）。N-Cadherin表達于細胞膜和（或）細胞質，其陽性表達率為38.1%（24/63）。Vimentin表達于細胞質，其陽性表達率為23.8%（15/63）。Fibronectin表達于細胞膜，其陽性表達率為7.9%（5/63）。根據EMT發生的判定標準，EMT陽性率為41.3%（26/63，圖1）。

圖1 免疫組織化學法檢測P53、Snail、Twist和EMT標志物的表達情況（IHC×400）Fig 1 Immune staining detected the expression of P53,Snail,Twist and markers of EMT（IHC×400）

2.2 乳腺癌P53的表達與患者臨床病理特征的關系

比較乳腺癌組織P53蛋白表達與患者年齡、腫瘤大小、組織學分級、淋巴結轉移、pTNM分期、ER、PR、HER-2的關系，發現其與組織學分級有關（P＜0.05），組織學Ⅲ級患者的P53表達率明顯高于Ⅰ、Ⅱ級患者。P53的表達與其他臨床病理特征無關（P＞0.05，表1）。

2.3 P53的表達和EMT發生與乳腺癌患者的預后分析

單因素分析顯示，淋巴結轉移、P53和EMT與患者預后相關，而年齡、腫瘤大小、組織學分級、pTNM、ER、PR、HER-2、Twist和Snail與預后無關（表2）。多因素分析顯示，淋巴結轉移、P53和EMT是患者預后的獨立影響因素。

表1 63例乳腺癌P53的表達與臨床病理特征的關系Table 1 Correlation between expression of P53 and clinicopathologic features of breast carcinoma

表2 乳腺癌患者預后影響因素Table 2 Univariate analysis of overall survival

2.4 P53、Twist、Snail和EMT發生的相關性

應用二元Logistic回歸分析P53、Twist、Snail和EMT發生的關系。以EMT為因變量Y，P53、Twist和Snail為自變量X，建立Logistic回歸模型：Logit（p）=-3.076+2.069×Twist+1.914×Snail。Logistic回歸模型似然比檢驗結果差異有統計學意義（P＜0.001），回歸系數Wald χ2檢驗顯示P＜0.05。Twist優勢比OR=7.915（2.089，29.990），Snail優勢比OR=6.782（1.254，36.688），因此可以認為Twist和Snail是EMT發生的危險因素，即Twist和Snail的表達可以促使EMT發生。在控制EMT的條件下進行P53與Twist，以及P53與Snail的偏相關分析，發現均呈正相關（P＜0.001）?？蓳苏J為在消除EMT影響的條件下，乳腺癌P53與Twist和Snail的表達間存在相關性。

3 討論

p53基因定位于17p13.1，其編碼的P53蛋白在DNA損傷修復、細胞凋亡和細胞周期阻滯等生物效應中發揮重要作用［4］。在腫瘤發生過程中，p53是最常見的突變基因之一。突變型P53不能有效激活P53下游的DNA損傷應激反應途徑，從而失去了腫瘤抑制功能。免疫組織化學是檢測腫瘤組織P53表達水平的常用手段。因野生型P53蛋白的半衰期較短，免疫組織化學法無法檢測到；而突變型P53半衰期增長，因此免疫組織化學法檢測到的P53均為突變型P53［5］。本研究發現隨著乳腺癌組織學分級的升高，P53的表達率增加，說明P53與乳腺癌的惡性程度有關。有研究也報道P53的表達與乳腺癌組織學分級相關，是患者預后不良的獨立預測因素之一［1］。

上皮細胞經歷EMT過程后會出現細胞間連接消失、細胞游走和侵襲能力增強。因此，腫瘤細胞經歷EMT是腫瘤發生浸潤轉移的重要途徑［6-7］，而探討EMT的發生機制和影響因素對于減少腫瘤轉移，延長患者生存時間具有重要意義。目前認為轉錄因子Twist和Snail在EMT的發生過程中具有重要作用。腫瘤細胞高表達Twist和Snail，可以抑制E-Cadherin等上皮標志物的轉錄，同時上調N-Cadherin等間質標志物的表達水平，從而介導EMT的發生［7-8］。本研究也發現，乳腺癌組織表達Twist和Snail能夠促進EMT的發生。

近年來有學者提出P53也參與調控EMT過程。有研究認為，P53可以通過激活miR-200、miR-192和miR-34等microRNA，降低ZEB1、ZEB2和Snail的表達，從而抑制EMT的發生［9-11］。因此，在p53基因突變的腫瘤細胞會出現P53功能缺失，從而促進EMT的發生。不僅如此，近年來研究發現某些突變型P53還具有獲得性功能，可以抑制野生型P53的活性或者誘導某些基因表達進而促進腫瘤的發生［4，12］。在子宮內膜癌，突變型P53能夠直接結合miR-130b的啟動子，抑制其轉錄，從而上調ZEB1的表達水平，促進EMT的發生并增強細胞的侵襲能力［13］。肺癌p53基因突變與Slug高表達和E-Cadherin低表達有關。沉默高侵襲性NSCLC細胞系中突變型P53的表達，能夠顯著降低Slug的水平，增加E-cadherin的表達，同時降低細胞侵襲能力。重新表達Slug能夠逆轉這些變化［14］。Zhang等［15］發現突變型P53能夠誘導MCF-10A發生EMT。在乳腺癌MCF7細胞轉入R175H和R273H兩種突變型P53會出現Snail1蛋白表達增加、E-Cadherin表達下降，同時細胞侵襲能力增加；沉默表達突變型P53的MDA-MB-231的Snail1的表達或者異位表達miR-34a，都能夠抑制細胞的侵襲特性，誘導上皮細胞標志物的再表達同時下調間質細胞標志物的水平［16］。上述研究表明突變型P53具有獲得性功能，能夠誘導腫瘤細胞發生EMT。但是這些研究主要探討了腫瘤細胞系表達突變型P53可以誘導EMT的發生，提高腫瘤細胞的侵襲和轉移能力，而關于腫瘤標本中突變型P53和EMT的相關性少有報道。因此，本研究以乳腺癌組織標本為研究對象，發現乳腺癌患者突變型P53的表達與轉錄因子Twist和Snail的表達呈正相關，而據上文所述Twist和Snail能促進EMT的發生。生存分析發現突變型P53和EMT均為乳腺癌預后的獨立影響因素。據此推測乳腺癌患者可能通過表達突變型P53上調Twist和Snail的表達，后者誘導腫瘤細胞發生EMT，進而促進轉移，影響預后。Coradini等［17］發現存在p53基因突變的乳腺癌其編碼頂端連接復合體的基因INADL、JAM2、JAM3、MAGI1、PARD6B和PVRL2的表達顯著下調，同時有編碼N-Cadherin的基因CDH2和細胞增殖與轉移相關基因CCNE2、CDK4、CDK6、MKI67和MTA1的過表達，進一步支持了上述結論。

目前，乳腺癌的復發和轉移仍然是威脅患者生存的重要原因。突變型P53參與乳腺癌發生發展的多個環節，能夠促進腫瘤的浸潤轉移，因此，針對突變型P53的治療策略很可能達到抑制腫瘤細胞轉移的效果，成為腫瘤治療的新思路。

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（2014-04-11收稿）

（2014-06-04修回）

（本文編輯：周曉穎）

Correlation and clinical significance of P53 expression with epithelial-mesenchymal transition in breast cancer

Lili HUO1,2,3,Hui LI1,2,3,Feng WEI1,2,3,Xiubao REN1,2,3
Correspondence to:Xiubao REN;E-mail:rwziyi@yahoo.com

Objective:This study aims to investigate the correlation and significance between the expression of P53 and epithelial-mesenchymal transition(EMT)in breast cancer.Methods:The expression patterns of P53,Twist,Snail,E-cadherin,N-cadherin,Vimentin,and Fibronectin protein were detected via immunohistochemistry in 63 cases with breast carcinoma.The correlation of P53 protein with clinicopathologic features and survival of breast carcinoma,as well as the relationship between the expression of P53 and EMT,was analyzed.Results:The expression rates of P53,Twist,Snail,and EMT are 44.4%(28/63),54.0%(34/63),68.3%(43/63), and 41.3%(26/63),respectively.The P53 protein expression is correlated with tumor grade(P＜0.05)but not with other clinicopathologic features(P＞0.05).The expression of P53 is also correlated with the expression of Twist and Snail,which are associated with EMT (P＜0.05).Multivariate survival analysis reveals that lymph node metastasis,P53,and EMT are independent prognostic factors.Conclusion:The expression of P53 is correlated with tumor grade and EMT in breast cancer,which can be used as an independent prognostic factor.Therefore,P53 may be an effective target for breast cancer therapy.

breast neoplasms,P53,epithelial-mesenchymal transition,prognosis,immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1000-8179.20140603

霍莉莉 碩士生在讀。研究方向為腫瘤微環境與腫瘤干細胞影響與機制。

天津醫科大學腫瘤醫院免疫室，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市腫瘤免疫與生物治療重點實驗室（天津市300060）

*本文課題受天津市應用基礎及前沿技術研究計劃項目資助（編號：12JCYBJC16100）

任秀寶 rwziyi@yahoo.com

E-mail：shanping.li@aliyun.com