卵巢癌患者腹水及外周血CD4+CD25+調節性T細胞含量及抑制功能的研究*

姚海榮 田 菁 李迎春 張文琪 郝 權

卵巢癌患者腹水及外周血CD4+CD25+調節性T細胞含量及抑制功能的研究*

姚海榮 田 菁 李迎春 張文琪 郝 權

目的：研究卵巢癌患者腹水及外周血單個核細胞（PBMC）中CD4+CD25+調節性T細胞（Treg）的表達差異、免疫調節功能及其含量與化療、復發的關系，探究其在卵巢癌腹腔微環境中發揮免疫調節的具體作用及意義。方法：采用流式細胞術分別檢測27例卵巢癌患者腹水及28例卵巢癌患者PBMC中CD4+CD25+/CD4+T細胞百分比，并根據收集標本時患者臨床特征進行分組，比較處于初治（PD）、化療后（AC）及復發（RD）3個階段卵巢癌患者腹水及PBMC中Treg含量的差異。應用免疫磁珠分選卵巢癌患者腹水及外周血Treg，與經羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（carboxyfluorescein succinimidylester，CFSE）標記的自體CD4+CD25-T細胞按不同比例（0：1，1：1，1：2及1：4）共培養，檢測Treg免疫抑制功能。結果：卵巢癌患者腹水中CD4+CD25+/CD4+T細胞百分比（28.25±14.06）%較PBMC中（14.6±4.74）%顯著增高（P＜0.000 1）。卵巢癌患者PD、AC及RD 3個階段腹水及PBMC中Treg含量均顯示為AC＞RD＞PD，且均有顯著統計學意義（P＜0.000 1）。體外實驗結果顯示，卵巢癌患者腹水中CD4+CD25+Treg可有效抑制CFSE標記的自體CD4+CD25-T細胞增殖，且抑制功能較外周血顯著增強（P＜0.01）。結論：卵巢癌腹腔微環境中存在CD4+CD25+Treg，且其含量及免疫抑制功能較外周血PBMC顯著增高，提示卵巢癌腹腔內更易發生免疫逃逸作用。卵巢癌患者化療后及復發階段腹水及PBMC中CD4+CD25+Treg含量均大于原發階段，提示化療可能促進卵巢癌患者體內Treg含量升高，而Treg升高可能參與促進腫瘤復發。

卵巢癌 調節性T細胞 腹水 免疫逃逸

Department of Gynecology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center of Can

cer Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin,Tianjin 300060,China

This work was supported by the Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology(No.12JCYBJC17000)

卵巢癌是常見婦科腫瘤之一，其死亡率高居婦科惡性腫瘤之首，總生存率為60%。由于尚無成熟的早期診斷方法，70%卵巢癌發現時已為晚期，治療極其困難［1］。即便經常規腫瘤細胞減滅術及化療得以有效緩解，80%～85%的患者短期內亦會出現復發與轉移，影響卵巢癌治療療效與預后。腹腔轉移是卵巢癌的重要病理特點。CD4+CD25+調節性T細胞（Treg）是一群具有免疫調節功能的抑制性細胞亞群，在腫瘤免疫逃逸過程中起到關鍵作用。近年來研究表明，在頭頸腫瘤、乳腺癌、胃癌、肺癌等腫瘤患者外周循環血及腫瘤局部中均發現CD4+CD25+Treg增多，并參與腫瘤免疫逃逸［2］。本研究旨在研究卵巢癌腹水及外周血中CD4+CD25+Treg含量及免疫調節功能差異，并初步討論其與卵巢癌化療及復發的關系，從而進一步探究CD4+CD25+Treg在卵巢癌腹腔微環境中發揮免疫調節的具體作用及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本采集 27例腹水標本及28例外周血標本采集于天津醫科大學附屬腫瘤醫院婦瘤科2012年3月至2013年5月卵巢癌患者，所有病例均經病理診斷或細胞學診斷證實。腹水標本收集于卵巢癌患者腹腔穿刺術后，用無菌引流袋置于冰中運送進行后續實驗。外周血標本均于清晨空腹采集靜脈血10 mL，EDTA抗凝。其中根據采集標本時患者臨床特點可分為初治患者標本（primary disease，PD，未接受任何治療），新輔助化療（紫杉醇+順鉑）后1周內患者標本（after chemotherapy，AC）以及復發患者標本（recurrent disease，RD，經過手術及化療等抗腫瘤治療后復發）。其中，腹水標本中處于PD，AC，RD 3期的分別有10，7，10例，外周血標本中處于PD，AC，RD 3期的分別有8，10，10例。經臨床及化驗檢查證實所有標本均無感染性疾病存在。該研究符合倫理學規定，并于采集標本前取得了被采集人的知情同意。

1.1.2 主要試劑及儀器 鼠抗人anti-CD4-FITC單克隆抗體、鼠抗人CD25單克隆抗體、鼠FITC IgG 1同型對照抗體、鼠PE IgG 1同型對照抗體（BD Pharmingen，美國），人CD4+Multisort kit、人CD25磁珠Ⅱ、MACS免疫磁珠分離儀（Miltenyi，德國），人重組IL-2（Peprotech，美國），人淋巴細胞CD3單克隆抗體、人淋巴細胞CD28單克隆抗體、CFSE（eBioscience，美國），RPMI-1640培養基（Gibco，美國），胎牛血清（Hyclone，美國），人外周血淋巴細胞分離液購自于天津灝洋生物公司，紅細胞裂解液購自于天津艾勒科技公司。流式細胞分析采用FACScan（BD Biosciences，USA），并采用FlowJo軟件進行數據分析。CFSE標記T細胞增殖采用Modfit軟件進行數據分析。

1.2 方法

1.2.1 細胞獲得、培養 卵巢癌患者無菌腹水標本處理：4℃，1 500 r/min離心10 min，PBS重懸，經紅細胞裂解液去除紅細胞，后經40 μm濾器過濾，細胞重懸于細胞培養體系（20%胎牛血清、RPMI-1640）于37℃、5%CO2培養箱中過夜，棄貼壁細胞，取懸浮細胞獲取單細胞懸液，進行后續實驗。卵巢癌患者外周血標本處理：外周血標本經Ficoll-Hypaque密度梯度法收集中間層單個核細胞層，用于后續試驗。

1.2.2 流式細胞術檢測CD4+CD25+Treg的表達 將上述獲得的卵巢癌腹水懸浮細胞以及外周血單個核細胞（PBMC）用PBS洗滌，調整濃度為1×106/mL，取懸液200 μL/管，同時加入FITC標記的鼠抗人CD4單克隆抗體和PE標記的鼠抗人CD25單克隆抗體各10 μL，并以FITC標記的抗小鼠IgG1κ同型抗體以及PE標記的抗小鼠IgG1κ同型抗體作為陰性對照，混勻，4℃避光孵育30 min，PBS清洗2次，上流式細胞儀分析檢測（計數105個細胞用于分析），采用FACScan FlowJo軟件進行數據分析。

1.2.3 CD4+CD25+Treg的分選 采用上述獲得腹水懸浮細胞懸液以及PBMC懸液，細胞計數后，應用人CD4+Multisort kit獲得CD4+T細胞，進一步對總CD4+T細胞再通過人CD25的磁珠陽性分選，得到CD4+CD25+T細胞以及CD4+CD25-T細胞，操作嚴格按照試劑盒說明進行。分離所得的CD4+CD25+T細胞經流式檢測濃度均＞90%。

1.2.4 CD4+CD25+T細胞免疫抑制功能的檢測 自腹水以及PBMC中分選出CD4+CD25+T細胞與CD4+CD25-T細胞，采用1.5 μmol/L的羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE）標記CD4+CD25-T細胞（至少0.5×105個細胞），室溫下孵育10 min，用預冷的胎牛血清終止標記反應，熒光顯微鏡下觀察CFSE標記效果。CD4+CD25+Treg與CFSE標記的CD4+CD25-T細胞按0：1，1：1，1：2及1：4比例于10%胎牛血清-RP M I-1640培養體系內共培養，并加入人淋巴細胞CD3單克隆抗體（1 μg/mL）、人淋巴細胞CD28單克隆抗體（1 μg/mL）以及人重組IL-2（150 IU/mL）作為激活因子。5天后流式細胞儀檢測CFSE表達，并使用Modfit軟件分析CFSE數據計算各組增殖指數（PI）。抑制率=（1-實驗組PI/對照組PI）×100%，其中只含有CD4+CD25-T細胞組為對照組，而對照組抑制率為0，增殖率為100%［3］。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 卵巢癌腹水及外周血中CD4+CD25+Treg的檢測

采用流式細胞儀FACScan進行檢測，在FSC-SSC散點圖上選定淋巴細胞群，以CD4-FITC陽性以及FSC設門，選定CD4+細胞分析CD25的表達。本研究中27例卵巢癌患者腹水中CD4+CD25+/CD4+T細胞百分比為28.25%±14.06%（圖1A，表1），28例卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+/CD4+T細胞百分比為（14.60±4.74）%（圖1A，表1），兩者之間有顯著統計學意義（P＜0.000 1，圖1B，表1）。

2.2 卵巢癌患者腹水及外周血中CD4+CD25+Treg的含量與臨床病理參數關系

分析腹水及外周血中CD4+CD25+Treg表達水平與臨床病理參數的關系可見其與患者的年齡、病理類型、臨床分期及分化程度無關，而外周血中CD4+CD25+Treg含量與化療療程相關（表2）。另外，根據采集標本時患者臨床特點分為PD、AC與RD 3組，腹水標本中，流式結果檢測顯示PD、AC及RD 3組內Treg含量分別為（16.10±1.96）%，（49.86± 5.71）%以及（25.28±2.92）%，3組間Treg含量具有顯著統計學差異（P＜0.000 1，圖2A，表2），而外周血標本中，流式結果檢測顯示PD、AC及RD 3組內Treg含量分別為（8.03±0.83）%，（19.47±1.31）%以及（14.98±0.43）%，且3組間Treg含量具有顯著統計學差異（P＜0.000 1，圖2A，表2）。進一步結果分析顯示，卵巢癌患者在不同年齡、病理類型、臨床分期、分化程度及化療療程下，PD、AC與RD 3組卵巢癌患者腹水及外周血中Treg含量均具有顯著統計學差異。另外，在PD、AC以及RD各期腹水種CD4+CD25+/CD4+T細胞百分比均較外周血顯著增高，并且具有統計學差異（P＜0.000 1，圖2B）。

2.3 卵巢癌腹水及外周血CD4+CD25+Treg免疫抑制功能的測定

磁珠分選腹水及外周血中CD4+CD25+Treg，純度均＞90%（圖3A）。腹水及外周血中CD4+CD25+Treg（suppressor cell，S）在S/R為1∶1、1∶2、1∶4比例下均可抑制自體CFSE標記的CD4+CD25-T細胞（responder cell，R）增殖。在S/R為1∶1、1∶2、1∶4比例下，16例腹水分選所得Treg對自體CD4+CD25-T細胞增殖的抑制率分別為（74.69±15.99）%、（71.15± 18.77）%以及（43.14±13.78）%，6例外周血分選所得Treg對自體CD4+CD25-T細胞增殖的抑制率分別為（58.12±5.59）%、（51.03±4.24）%以及（28.03± 5.44）%（圖3B），腹水Treg抑制功能較外周血Treg增強，且差異具有統計學意義（P＜0.05，圖3C）。

圖1 卵巢癌腹水及外周血中CD4+CD25+Treg表達Figure 1 Expression of CD4+CD25+regulatory T cell in blood and ascites of patients with OC*P＜0.0001

表1 卵巢癌腹水及外周血中CD4+CD25+Treg的含量Table 1 Frequency of CD4+CD25+Treg in ascites and blood of patients with OC

表2 卵巢癌患者腹水及外周血中CD4+CD25+Treg表達與臨床病理參數關系Table 2 Relationship of CD4+CD25+Treg expression in ascites and blood of patients with OC and their clinicopathological features

?*P＜0.000 1A：Percentages（±s）of CD4+CD25+T cells in CD4+T cells in blood and ascites of patients with OC in PD，RD，and AC stages；B：Comparison of the expression of CD4+CD25+T cells in blood and ascites of patients with OC in PD，RD，and AC stages圖2 PD、AC以及RD期卵巢癌患者腹水及外周血中CD4+CD25+調節性T細胞的含量差異Figure 2 Differences in the frequency of CD4+CD25+regulatory T cells in blood and ascites of patients with OC in PD，RD，and AC stages

圖3 腹水及外周血CD4+CD25+調節性T細胞免疫抑制功能的測定Figure 3 Suppressor function of CD4+CD25+Treg obtained from ascites and blood of patients with OC

3 討論

通常情況下，免疫系統能夠清除轉化的異常細胞而避免腫瘤的發展。而大量研究顯示，腫瘤細胞可通過某些機制逃避機體的免疫監視，發生免疫逃逸，而腫瘤局部存在多種類型的免疫抑制性細胞，其中CD4+CD25+Treg在腫瘤的發生發展過程中起到重要作用［4］。近年來研究表明，多種癌癥患者（乳腺癌、結腸直腸癌、胃癌、肝癌）外周循環血中均發現CD4+CD25+Treg細胞增多。動物實驗已證實：給荷瘤小鼠應用抗CD25單抗抑制動物體內Treg，可提高小鼠抗腫瘤免疫功能。而體外實驗也證實從外周血中去除Treg，可以產生更多的細胞毒細胞，如CTL和LAK/NK細胞［5］。Treg可抑制體內活化的T細胞而限制抗腫瘤免疫反應的發生，從而在維持腫瘤免疫耐受中發揮重要作用［6］。

報道指出，Treg也可以在腫瘤部位選擇性地聚集，認為外周血Treg不能完全體現腫瘤調節性T細胞的具體作用［7］。已有研究證實，卵巢癌患者外周血、腹水內均發現CD4+CD25+Treg細胞數目較正常人外周血及良性腹水中增多［8］。而胃癌患者腹水內CD4+CD25+Treg含量增多與疾病進展相關［9］。腹腔復發與轉移是卵巢癌的重要特點，而目前少有針對腹腔微環境內Treg的具體功能作用的研究。本研究證實卵巢癌腹水內CD4+CD25+Treg含量顯著高于外周血Treg含量（P＜0.000 1）。這可能是由于腫瘤局部趨化因子對CD4+CD25+Treg細胞在腫瘤局部的募集具有重要作用，例如CD4+CD25+Treg細胞表達趨化因子受體CCR4，卵巢癌等腫瘤細胞可以分泌CCR4配體CCL22，Treg通過表達的CCR4向腫瘤部位遷移［8，10］。另外，在體外的細胞培養研究［11］中發現，人類上皮性卵巢癌細胞培養上清能夠誘導初始非調節性T細胞向調節性T細胞的轉化，其中轉化的具體機制十分復雜，可能涉及到多種細胞因子及非細胞因子微粒成分的具體作用。這些可能會導致Treg更傾向于聚集在卵巢癌腹腔微環境內。

另外，Treg維持腫瘤免疫耐受可能主要是通過抑制體內活性腫瘤殺傷細胞來發揮作用。Treg能夠強有力地抑制效應T淋巴細胞的活化、增殖及功能［11-12］本研究成功應用磁珠分選方法自卵巢癌腹水及外周血中分選出CD4+CD25+Treg，驗證其在S/R為1：1、1：2、1：4比例下均可抑制自體CFSE標記的CD4+CD25-T細胞增殖，并且在S/R為1：1的比例下抑制能力最強（抑制率最高可達90%）。并且在三種比例下腹水Treg較外周血Treg抑制能力均顯著增強（P＜0.05）。進一步證實腹水內Treg較外周血Treg更能代表卵巢癌患者體內Treg介導的免疫作用，為進一步針對Treg的免疫治療提供新的視角。目前針對Treg發揮免疫抑制功能相關機制的研究主要有細胞接觸依賴性機制和分泌抑制性細胞因子等方面。體外實驗證實，人Treg發揮免疫調節活性可能以細胞表面細胞毒性T淋巴細胞抗原-4（CTLA-4）與抗原呈遞細胞（APCs）或者活化的T細胞表面B7（CD80和CD86）之間的交聯作用轉導反向信號來抑制效應細胞的活性［13］，也可能通過高表達FasL并通過Fas/FasL途徑抑制脂多糖（LPS）誘導的單核細胞存活［14］。另外，動物腫瘤實驗模型中，腫瘤局部Treg可分泌IL-10，IL-10可顯著抑制機體的抗腫瘤免疫功能［15］。而有關卵巢癌局部Treg發揮免疫抑制功能的機制還有待進一步探究。

本研究進一步探討Treg與卵巢癌治療及疾病進展的相關程度，發現接受化療（紫杉醇+順鉑）后一周內的卵巢癌患者腹水與外周血Treg含量均最高，并且復發患者次之，初治患者體內Treg含量最少（P＜0.000 1），并且每一階段內腹水內的Treg含量均高于外周血（P＜0.000 1）。這進一步揭示Treg含量與卵巢癌患者疾病進展相關，且接受化療后Treg含量相對增高，這可能與腫瘤患者接受化療后，自身機體免疫力低下，Treg細胞數量相對增多有關。而有研究報道多西紫杉醇也可引起天然CD4+CD25+Treg輕度減少，這可能由多西紫杉醇選擇性地清除CD4+CD25+Treg引起［16］。這可能是由于化療藥物的種類、劑量、使用周期、藥物代謝半衰期以及不同腫瘤來源Treg細胞周期不同造成的化療對于Treg作用不同所引起的。具體相關化療對不同腫瘤患者體內Treg含量及功能的具體作用和機制以及Treg在化療過程中是否起到作用還有待進一步探究。而且在胃和食道癌的病人外周血中的動態監測發現晚期患者的Treg比例比早期患者高，手術切除后Treg比例降低，但是復發后Treg又上升［18］。與本研究得出復發卵巢癌患者腹水及外周血Treg顯著高于初治卵巢癌患者的結果一致，進一步證實Treg含量與癌癥進展相關，并且提示Treg有可能參與卵巢癌復發過程。

腫瘤細胞與Treg之間的關系錯綜復雜，全面了解其中的機制，并進行相應的處理，如采取特異性及非特異性措施清除Treg或者阻斷其他T細胞向Treg的轉化途徑及Treg發揮抑制作用的途徑，開拓出一條有效抑制腫瘤免疫逃逸的新路?？傊?，有效調節Tregs的數量及功能，尤其對于卵巢癌患腹腔微環境內Treg的針對治療，有助于控制腫瘤進展并進一步增強腫瘤免疫治療效果，也是在今后的免疫治療當中需要考慮的重要問題之一。

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（2013-08-07收稿）

（2013-11-14修回）

（本文編輯：楊紅欣）

Frequency and suppressor function of CD4+CD25+T cells in ascites and blood of patients with ovarian cancer

Hairong YAO,Jing TIAN,Yingchun LI,Wenqi ZHANG,Quan HAO
Correspondence to:Quan HAO;E-mail:haoquandoctor@126.com

Objective:CD4+CD25+regulatory T cells(Treg)may contribute to tumor progression by suppressing antitumor immunity.The function of Treg in antitumor immunity regulation in the peritoneal microenvironment of ovarian cancer(OC)was investigated and compared with the circulating Treg to elucidate OC immune escape.Methods:Flow cytometry was used to determine the proportion of CD4+CD25+T cells in CD4+T cells in ascites of 27 patients with OC and in peripheral blood lymphocytes of 28 patients with OC.The samples were analyzed and classified in three stages:primary disease(PD),after chemotherapy(AC),and recurrence disease(RD),according to the clinical conditions of the OC patients upon donating the samples.The percentage of Treg in the three groups was determined in ascites and blood.CD4+CD25+T cells were isolated from ascites and peripheral blood of patients with OC using magnetic sorting(MACS)system.The cells were then tested for regulatory function through coculture with carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester-labeled autologous CD4+CD25-responder cells.Results:The proportion of CD4+CD25+T cells in CD4+T cells significantly increased in ascites(28.25%±14.06%)compared with that in blood(14.6%±4.74%;P＜0.0001).The Treg in ascites and blood in AC showed higher proportion(P＜0.0001)than those in the PD and RD;the proportion in RD was higher than that in PD (P＜0.0001).Moreover,the Treg in ascites mediated a significantly higher suppression compared with the Treg in peripheral blood(P＜0.001).Conclusion:The frequency and suppressor function of Treg were significantly higher in ascites than in peripheral blood.This finding suggests more possibility for escape immune surveillance in the peritoneal microenvironment.Moreover,the proportion of Tregin AC was higher than that in PD or RD;the proportion in RD was higher than that in the PD.Chemotherapy may favor the expansion of Treg,which may promote the recurrence of cancer.

ovarian cancer,ascites,regulatory T cell,immune escape

10.3969/j.issn.1000-8179.20131281

姚海榮 碩士研究生。研究方向為婦科腫瘤臨床與基礎研究。

天津醫科大學腫瘤醫院婦瘤科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室（天津市300060）

*本文課題受天津市應用基礎及前言技術研究計劃項目（編號：12JCYBJC17000）資助

郝權 haoquandoctor@126.com

時間：2014-05-19 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1099.R.20140519.0952.003.html

E-mail：yaohairong88@126.com