不同N/C比納米碳氮膜對多壁碳納米管抗凝血性能的影響

趙夢鯉，李德軍，董 磊，劉小綺，曹 葉

（天津師范大學物理與材料科學學院，天津300387）

碳納米管（CNTs）是繼C60后被發現的碳的又一同素異形體[1]，由于具有大表面積、封閉的拓撲構形、豐富的電子結構、不同的螺旋結構、超輕重量、高化學和熱穩定性以及高機械強度等特性，碳納米管具有很多獨特的理化性質，因此，在諸如醫學診斷治療、生物傳感器和醫學材料等研究和應用領域受到極大關注[2-7]，展現了廣闊的應用前景.但隨著對碳納米管生物醫學應用研究的不斷加深，材料本身逐漸暴露出一定的缺陷和問題，如碳納米管本身化學穩定性高，一般不溶于任何溶劑，所以在溶液中易聚集成團，這既妨礙了對其進行分子水平的操作和研究，也難于將它納入生物體系，導致它在生物醫學領域的應用受到限制[8-12].因此，為保留碳納米管本身的優異性能，同時克服強疏水性的缺陷，采用物理或化學方法對其進行表面修飾是非常必要的.

在近些年的研究[13-15]中，碳氮膜（CNx）被證實具有良好的生物相容性和潤濕性，是一種被認可的生物涂層材料.將CNx涂層覆蓋在MWCNTs表面既可在拓撲結構上保持MWCNTs原有的大比表面積和高孔隙度的優勢，又可借用CNx膜良好的潤濕性，從表面性能上提高MWCNTs的親水性.本課題組的前期工作已經發現，在MWCNTs表面沉積納米碳氮膜可以有效提高MWCNTs的血液相容性[16-17].進一步考慮到作為生命體的必須元素，N元素參與蛋白質的合成和細胞表面識別等生命活動，具有生物活性，因此，N元素在材料中的含量和引入位置對其生物相容性的改善均有影響[18].本研究選擇可在較低的轟擊能量下連續沉積任意厚度膜層、并能在室溫下合成具有理想化學配比化合物膜層的IBAD技術，通過控制實驗參數，調節引入N元素的比率，在MWCNTs表面沉積不同N/C比率的納米CNx薄膜，研究不同N含量CNx薄膜對MWCNTs抗凝血性的影響.

1 實驗方法

1.1 沉積納米CNx薄膜的MWCNTs的制備

MWCNTs（中國深圳市納米港有限公司提供）純度為 90%，直徑為 40～50 nm，長度為 5～15 μm.為了方便生物實驗，制備的MWCNTs材料需被噴涂在直徑15 mm的圓形SiO2基片上，具體方法為：首先使用CVD設備在SiO2基片上燒制一層C層，以增加MWCNTs與SiO2基片之間的結合力；然后，將MWCNTs、十二烷基硫酸鈉（SDS）和去離子水按質量比60∶3∶170的比例混合，置于容器中以功率400 W超聲處理10 min后，按轉速10 000 r/min離心15 min，最終形成穩定的懸浮溶液；接下來取懸浮液上層噴涂于基片上，為保證基片上的MWCNTs等量，每個基片噴涂4 mL碳納米管懸浮液；最后，將噴涂后的樣品置于去離子水中浸泡10 min，后置于蒸鍋內高溫高壓（126℃，0.15 MPa）60 min除去SDS，取出后置于烘箱干燥即可.

MWCNTs的表面功能化采用高真空離子束輔助沉積系統（IBAD）.沉積過程中濺射氣體選用純度均為99.99%的氬氣和氮氣，本底真空為1.9×10-4Pa，工作氣壓保持在 1.2×10-2～1.3×10-2Pa.加速電壓為 200 V，放電電壓為70 V，使用濺射槍轟擊純度為99.9%的石墨靶，濺射能量為1.05 keV，濺射束流為25 mA；N離子輔助能量為200 eV，通過改變輔助槍的束流（5、15和25 mA）調節在MWCNTs樣品上所沉積CNx膜的N/C比.

1.2 沉積納米CNx薄膜的MWCNTs的結構特征測試

實驗樣品的結構表征采用JEOL JSM-6700F型掃描電子顯微鏡（SEM），極性功能基團成分、含量、分布和鍵合狀態分析使用PHI5000型X線能譜儀（1 486.6 eV的Al Kα射線源），通過CAM KSV021733型光學接觸角測量儀測試表面功能化前后水在碳納米管材料樣品上的接觸角.

1.3 沉積納米CNx薄膜的MWCNTs的抗凝血性測試

血液相容性中最為關鍵的部分是血栓生成.采用血小板黏附實驗和動態凝血實驗測試MWCNTs和沉積納米CNx薄膜的MWCNTs的抗凝血性能.

取MWCNTs和表面沉積不同N/C比CNx膜的MWCNTs樣品各3片，分別放入24孔板中.陰性對照組3片，放有與實驗材料同尺寸并涂有2%甲基硅油的SiO2基片；陽性對照組3片，為與實驗材料同尺寸的SiO2基片.健康新西蘭兔耳動脈取血10 mL，加入抗凝劑離心10 min，將獲得的富含血小板的血漿滴在樣品、陰性和陽性對照組的表面，并在37℃條件下培養15 min，拿出計數，統計血小板黏附率.計算血小板在樣品表面黏附率的方法為：

式（1）中：A為抗凝血中的血小板數；B為與材料作用后的抗凝血中的血小板數.為保證實驗結果的可靠性，本實驗重復3次，最終結果取3次平行實驗的統計平均值.另準備一組，在SEM下觀察樣品表面黏附血小板的形態.

凝血實驗是檢測凝血因子、反映凝血機理的重要手段和指標.動態凝血時間實驗反映了血液中游離的血紅蛋白的溶解狀況和血液在材料表面的凝血程度.實驗取新鮮的健康兔血，每個樣品上滴加0.1 mL，并開始計時.5、10、20、30、40和 50 min時依次進行統計，統計時每種材料各取出1個樣品放到含有50 mL蒸餾水的燒杯中，均勻震蕩.此時沒有形成血栓的血紅細胞將被溶解，血紅蛋白自由分散在溶液中，使用天津喀納斯光學分析儀器有限公司生產的721型分光光度計，在540 nm的波長下測量樣品的光密度（O.D.540nm），光密度值越高，說明形成血栓的紅細胞越少，材料的抗凝血性越優秀.同樣，取3次平行試驗的平均值，將O.D.540nm平均值繪成動態凝血時間曲線圖.

2 結果與討論

圖1為噴涂在SiO2表面的MWCNTs的表面形貌.

圖1 樣品的SEM圖Fig.1 SEM images of the samples

從圖1（a）可以看出，噴涂在SiO2基片上的MWCNTs結構疏松，表面粗糙，存在大量孔洞.而在MWCNTs表面沉積CNx膜后，材料表面形貌略微平整，孔洞減少，且隨著輔助槍束流的增大，表面形貌更加平整，如圖 1（b）、1（c）和 1（d）所示.這一方面是因為 CNx膜包覆在MWCNTs表面，使得材料表面平整；另一方面，隨著束流的增大，被離子束打斷的MWCNTs數目增多，也填補了MWCNTs材料表面的孔洞，使材料更加平整.通過實驗前在Si片表面測試沉積率可知，改變輔助槍束流基本不影響沉積CNx薄膜的厚度，CNx的沉積率為19～20 nm/h.實驗沉積時間為30 min，因此覆蓋在MWCNTs表面的CNx薄膜厚度約為10nm.

同時，材料水接觸角的實驗結果反映出：MWCNTs具有很強的疏水性，接觸角達到135.80°，如圖2（a）所示.在MWCNTs表面沉積納米CNx膜后，樣品親水性明顯提高，材料由疏水性物質轉變為親水性物質，如圖 2（b）、圖 2（c）和圖 2（d）所示.由圖 2 可以看出，隨著輔助槍束流的增大，沉積納米CNx膜的MWCNTs親水性不斷提高，當束流為25 mA時，樣品的接觸角達到最小值24.72°.材料抗凝血性的優劣與材料表面的粗糙程度和親水性相關，在一定范圍內，材料表面越平滑、親水性越好，其抗凝血性就越好[19-20].綜合SEM和接觸角的測試結果，在MWCNTs上沉積納米CNx膜可以改善MWCNTs材料的抗凝血性；同時，隨著輔助槍束流的增大，沉積CNx膜的MWCNTs材料的抗凝血性變得更加優異.

圖2 樣品的接觸角圖Fig.2 Contact angle images of the samples

為確定沉積CNx膜MWCNTs中N和C兩元素的含量及成鍵狀態，對MWCNTs和沉積CNx膜的MWCNTs樣品進行XPS分析，結果如表1和圖3所示.

表1 MWCNTs和沉積CNx膜的MWCNTs的原子百分比（%）和結合能（eV）Tab.1 Atomic content percent and binding energy of MWCNTs with and without CNxcoatings

圖3 樣品的XPS譜圖Fig.3 XPS spectra of the samples

由表1可知，XPS結果顯示MWCNTs中含有0.53%的N，這是由于制備所得MWCNTs在結構上疏松多孔（如圖1（a）所示），暴露在空氣中，表面吸附有空氣中的N2所致；沉積納米CNx膜的MWCNTs中N含量受輔助槍束流大小的影響，輔助槍束流為5、15和25 mA時，N元素含量依次為17.04%、21.34%和17.54%，換算成N和C兩原子的比例（N/C）依次為0.20、0.27和 0.21，記為 CN0.20、CN0.27和 CN0.21.由此可見，輔助槍束流的大小與材料含氮量高低相關，輔助槍束流過高或過低均不利于N元素在MWCNTs材料上的積累，為獲得較高的含N量，15 mA的輔助槍束流較為合適.

圖3為表面功能化前后的碳納米管經高斯擬合的 C1s和 N1s譜圖.由圖 3（a）可以看出，MWCNTs中只存在C峰，C元素之間以sp2C—C（284.7eV）和sp3C—C（285.6 eV）兩種雜化方式結合.沉積納米CNx（x=0.20、0.27和0.21）膜的MWCNTs的N1s譜圖顯示，N元素以sp2N—C（400.1 eV）和sp3N—C（398.7 eV）2種鍵合狀態存在于CNx薄膜中，且從N1s譜圖中可以看出，sp3N—C雜化占主要成分，并且隨著N/C比的增加，sp3N—C鍵的比例也隨之增大.

圖4顯示了MWCNTs和沉積CNx（x=0.20、0.27和0.21）膜MWCNTs樣品表面血小板的黏附率.

圖4 樣品表面的血小板黏附率Fig.4 Adhension rates of platelets on the samples

由圖4可以看出，幾種材料表面血小板黏附的大小依次為：陽性對照組>MWCNTs>沉積CN0.27膜的MWCNTs>沉積CN0.20膜的MWCNTs>沉積CN0.21膜的MWCNTs>陰性對照組.因此，在碳納米管表面沉積CNx膜有效地抑制了血小板黏附和血栓形成.影響材料抗凝血性能的因素主要有樣品的表面粗糙度、親疏水性和表面電荷分布等.表面粗糙意味著大的表面積，血小板越容易黏附，抗凝血性能就會越差[21].因此，CNx膜作為一種光滑薄膜覆蓋在MWCNTs表面，可以有效降低材料表面粗糙度，進而達到抑制血小板黏附的目的.由接觸角的測試結果可知，沉積CN0.21膜的MWCNTs的親水性最強，因此其表面黏附的血小板數目最少.此外，血栓在材料表面的形成與纖維蛋白原表面電荷轉移到材料表面有關，當纖維蛋白原失去電荷后會轉變成纖維蛋白單體和血纖維蛋白肽，這種交聯的纖維蛋白單體最終導致血栓的形成[22-23].由CNx薄膜中N原子的電子結構看，5個價電子中的4個形成與C原子價電子類似的結構，1個剩余.sp3雜化中，這個剩余電子將填充到4個sp3軌道中的任意1個，形成1個三角錐形的三鍵和1對孤對電子[24-26].所以，沉積CNx薄膜的MWCNTs具有優于MWCNTs的抗凝血性的原因是由于CNx薄膜中孤對電子的存在阻礙了電荷從纖維蛋白原向材料表面的轉移，進而抑制了纖維蛋白原向交聯纖維蛋白單體轉化，提高了抗凝血性.

圖5顯示了掃描電鏡下MWCNTs和沉積CNx（x=0.27、0.21）膜MWCNTs材料表面的血小板形態.

圖5 血小板和紅細胞在不同樣品表面的掃描電鏡圖Fig.5 SEM images of the platelets and red cells adhered on different samples

由圖5（a）可以看出，黏附在MWCNTs表面的部分紅細胞變形，說明MWCNTs對血小板具有一定的毒副作用；同時，黏附其上的血小板變形嚴重，伸出細長偽足，團聚糾纏在一起，易形成血栓.由圖5（b）和圖5（c）可知，沉積CNx膜的MWCNTs表面紅細胞呈圓餅狀，無變形，說明表面的CNx膜降低了MWCNTs對紅細胞的毒性，且黏附在材料表面的血小板團聚少，偽足短小，分布分散，不易形成血栓.對比圖4（b）和圖4（c）還可以發現，沉積CN0.21膜的MWCNTs表面血小板最為分散，變形最少，驗證了血小板黏附率的測試結果.

圖6顯示了MWCNTs和沉積CNx膜MWCNTs的動態凝血時間.動態凝血時間曲線越平緩，說明凝血時間（O.D.540nm=0.10時的時間定為凝血時間）越長，凝血因子被激活的程度越低，材料的抗凝血性越好.從圖6中可以發現，沉積3種不同N/C比CNx膜的MWCNTs的凝血曲線均較MWCNTs的平滑，且OD值達到0.10的時間更晚，這說明在碳納米管表面沉積CNx膜可以達到延長材料動態凝血時間的目的，且隨著N/C比的增高，凝血時間不斷增長，凝血因子在沉積CNx膜的MWCNTs材料上被激活的程度越低，其抗凝血性越優秀.

3 結論

本研究采用離子束輔助沉積（IBAD）方法在MWCNTs表面沉積納米CNx薄膜，通過控制氮氣輔助槍束流來控制薄膜中的含氮量.實驗發現：在MWCNTs表面沉積納米CNx薄膜可降低MWCNTs材料的表面粗糙度，顯著提高MWCNTs的親水性，血液在沉積納米CNx薄膜MWCNTs表面的動態凝血時間長，血小板黏附率低，紅細胞形態健康，這說明使用物理方法在MWCNTs表面沉積納米CNx薄膜成功達到了改善MWCNTs抗凝血性的目的.同時，樣品表面粗糙程度、親水性和抗凝血性的提高對應較高的輔助槍束流和含氮量，說明抗凝血性的優劣不是單一因素作用的結果，為達到最優化沉積CNx薄膜MWCNTs抗凝血性的目的，需要綜合考慮N含量、粗糙度和親水性等因素，在盡量提高氮元素含量的同時減小粗糙度，提高親水性.離子束輔助沉積方法可通過調節轟擊能量和束流大小等條件控制達到抗凝血性最優值，該方法在生物醫用材料改性方面具有良好的發展前景和應用價值.

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