抗HSV-2單鏈抗體和堿性磷酸酶融合蛋白的制備

，，

(浙江工業大學 藥學院，浙江 杭州 310032)

生殖器皰疹(GH)是一種常見的性傳播疾病，主要通過水平性接觸傳播，也能垂直感染胎兒及新生兒，導致流產及新生兒死亡.GH主要由單純皰疹病毒II型(HSV-2)感染所致[1].近年來的流行病學調查表明：HSV-2感染與宮頸癌的發生有關[2-3]，還會增加人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的風險[4-5].Looker KJ等根據全球12個地區的匯總數據估計，2003年全球15～49歲人群中，HSV-2感染的患病率約為16.2%，發病率約為0.7%，僅2003年全球新增HSV-2感染者約2 360萬人[6].因此，建立一種簡便、快速和低成本的HSV-2初篩方法，對GH的輔助診斷和控制傳播具有重要的意義.本研究為了探索前期篩選到的高特異性抗HSV-2糖蛋白B的單鏈抗體在GH診斷中的應用價值，構建了抗HSV-2單鏈抗體和堿性磷酸酶的融合表達載體，并進行了包涵體的復性研究.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株及質粒

大腸桿菌BL21(DE3)和DH5α由本實驗室保存，質粒pLac-duet-1-AKP和pCANTAB5E-H3由杭州遠方生物科技有限公司提供.

1.1.2 酶及主要試劑

限制性內切酶NotI、NcoI和T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司，DNA和蛋白購自Fermentas公司，DNA凝膠回收試劑盒、質粒小量抽提試劑盒和堿性磷酸酶檢測試劑盒購自碧云天公司，Ni2+-NTA基質購自QIAGEN公司.

1.2 方 法

1.2.1 融合表達載體pLac-H3-AKP的構建

質粒pLac-duet-1-AKP是將pETduet-1(Novagen公司)質粒中T7啟動子用大腸桿菌Lac啟動子替代，并插入了一個進化后酶活性提高30倍左右的大腸桿菌堿性磷酸酶基因片段；pCANTAB5E-H3是從本室早先構建的噬菌體抗體庫中篩選到的針對單純皰疹病毒糖蛋白B抗原的N端特異性中和抗體，這個抗體識別抗原的立體結構，能有效封閉病毒與相應細胞受體的結合位點從而阻斷病毒侵入細胞.分別用限制性內切酶NotI和NcoI雙酶切，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳目標條帶用凝膠回收試劑盒回收后用T4 DNA連接酶連接，產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布含氨芐青霉素的LB培養平板37 ℃培養過夜，次日挑取單菌落培養，抽提質粒用NotI和NcoI雙酶切鑒定克隆是否含有目標載體，含預期大小基因片段的克隆送上海生工測序，測序正確的克隆命名為pLac-H3-AKP.

1.2.2 融合蛋白的表達及包涵體的制備

將表達載體pLac-H3-AKP轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，涂布含氨芐青霉素的LB培養平板37 ℃培養過夜，次日挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB培養基中37 ℃培養，再次抽提質粒雙酶切確認是否含有目標載體.將確認后的克隆接種至含氨芐青霉素的LB培養基中培養過夜，次日按1：100比例接種于1 L新鮮的含氨芐青霉素的LB培養基中，37 ℃搖床振蕩培養至OD600為0.8左右，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，繼續37 ℃搖床振蕩誘導培養4 h.4 ℃，4 000 r/m收集菌體15 min，每克濕菌體用10 mL PBS洗滌兩次，再以相同比例的含有0.5 mol/L NaCl的預冷PBS重懸細菌，反復凍融三次后，放冰水浴中超聲至菌體完全裂解，12 000 r/m離心15 min，收集包涵體沉淀.

設置無質粒和空白質粒轉化對照組，并設計了各組未誘導全菌、誘導全菌、破菌后上清和沉淀進行12%SDS-PAGE電泳以確定表達產物的定位.

1.2.3 包涵體的純化

每克包涵體用5 mL洗滌緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，2 mol/L尿素，1% Triton X-100，pH 8.0)洗滌包涵體3次.洗滌后的包涵體復性前采用兩步變性法處理：每300 mg包涵體用1 mL裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，6 mol/L鹽酸胍，pH 8.0)重懸后室溫搖床振蕩過夜以溶解包涵體，次日12 000 r/m離心15 min，棄去沉淀，上清用40倍體積超純水迅速稀釋，使蛋白重新聚集沉淀過夜，12 000 r/m離心30 min，保留沉淀，用變性緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，pH 8.0)重新溶解沉淀，12 000 r/m離心15 min，上清過0.45 μm濾膜備用.

按制造商推薦的方法用10倍柱體積的平衡緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，20 mmol/L咪唑，pH 8.0)平衡鎳離子螯合介質.將尿素變性溶解的包涵體溶液與平衡好的螯合介質混勻，室溫溫和混勻30 min使之充分結合，用10倍柱體積的洗滌緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，40 mmol/L咪唑，pH 8.0)充分洗滌鎳離子螯合介質.從低到高以不同濃度梯度的咪唑洗脫緩沖液競爭性洗脫目的蛋白，每個濃度2個柱體積洗脫.12% SDS-PAGE電泳分析目的蛋白有效洗脫濃度和純度.洗脫液中加入終濃度為10 mmol/L DTT打開二硫鍵.用含有50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素的pH為8.0的緩沖液低溫透析除去咪唑和DTT，用Bradford法測定蛋白濃度.

1.2.4 包涵體的復性

復性緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L β-巰基乙醇，0.5 mol/L尿素，0.5 mol/L精氨酸，1 mmol/L GSSG和1 mmol/L GSH，pH 8.0)，蛋白的初始復性質量濃度為0.1 mg/mL，放4 ℃冰箱中復性24 h.

1) 不同pH值對復性效果的影響

將透析好的變性蛋白逐滴加入到預冷的不同pH值的復性緩沖液中，pH值分別為7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，蛋白的初始復性質量濃度為0.1 mg/mL.放4 ℃冰箱中復性24 h，12 000 r/m離心15 min，測定上清中AKP比活.

2) 不同初始復性蛋白質量濃度對復性效果的影響

將透析好的變性蛋白逐滴加入到預冷的復性緩沖液中，初始的復性蛋白質量濃度分別為0.05，0.1，0.15，0.2，0.25 mg/mL.放4 ℃冰箱中復性24 h，12 000 r/m離心15 min，測定上清中AKP比活.

3) 不同濃度比例的GSSG和GSH對復性效果的影響

將透析好的變性蛋白逐滴加入到預冷的不同濃度比例的復性緩沖液中，GSSG終濃度為1 mmol/L，GSH終濃度分別為0.5，1，2，3，4 mmol/L，蛋白的初始復性質量濃度為0.1 mg/mL.放4 ℃冰箱中復性24 h，12 000 r/m離心15 min，測定上清中AKP比活.

4) 不同時間對復性效果的影響

將透析好的變性蛋白逐滴加入到預冷的復性緩沖液中，蛋白的初始復性質量濃度為0.1 mg/mL.放4 ℃冰箱中分別復性12，24，36，48，60 h，12 000 r/m離心15 min，測定上清中AKP比活.

1.2.5 復性后融合蛋白的分析鑒定

進行8% SDS-PAGE和抗原結合活性鑒定：用包被緩沖液稀釋HSV-2糖蛋白B抗原至1 μg/mL，取100 μL加入96孔板4 ℃包被過夜，空白對照孔加等量包被液.次日移去包被液，用含0.05% Tween-20的PBS洗3次，1% BSA 37 ℃封閉1 h，移去封閉液，用含0.05% Tween-20的PBS洗3次，加入100 μL復性后的融合蛋白(1 μg/mL)37 ℃反應1 h，PBS洗3次，然后分別加入50 μL堿性磷酸酶試劑盒中溶液I和溶液II，37 ℃顯色15 min，再加入50 μL堿性磷酸酶試劑盒中溶液III，與空白對照對比觀察顏色變化.

2 結果與分析

2.1 融合表達載體pLac-H3-AKP的構建

重組質粒經雙酶切消化后進行1%瓊脂糖凝膠電泳可見一條大小約5 200 bp的條帶和一條大小約750 bp的條帶，理論上重組質粒應該由一個大小約5 200 bp的載體片段和一個大小約750 bp的單鏈抗體基因片段組成，可見電泳顯示的兩個條帶大小均與理論值相符(圖1)，表明成功地構建了融合表達載體pLac-H3-AKP.該載體含Lac啟動子，可用IPTG誘導表達，同時在堿性磷酸酶的羧基端設計有編碼6個組氨酸的密碼子序列使表達的融合蛋白含有6個組氨酸，便于金屬螯合層析純化.

M-1 kb DNA Ladder; 1-重組質粒雙酶切產物

2.2 融合蛋白的表達及包涵體的制備

對比未經IPTG誘導的全菌蛋白，可見誘導后的全菌蛋白及破菌沉淀在SDS-PAGE電泳中均出現約75 kD大小的條帶(圖2)，而經誘導后的破菌上清中未見明顯差異條帶，表明融合蛋白在大腸桿菌中成功表達且主要以包涵體形式存在.

M-Protein Marker；1-未誘導全菌；2-誘導全菌；3-誘導后破菌上清；4-誘導后破菌沉淀

2.3 包涵體的純化

12% SDS-PAGE電泳顯示，純化后的包涵體蛋白能被適當濃度的咪唑有效洗脫，在200 mmol/L咪唑洗脫時純度達到75%左右(圖3).

1-未純化包涵體；2-100 mmol/L咪唑洗脫；3-150 mmol/L咪唑洗脫；4-200 mmol/L咪唑洗脫；5-250 mmol/L咪唑洗脫

2.4 包涵體的復性

1) 不同pH值對復性效果的影響

通常來說，復性緩沖液的pH值需要大于7.0，用來防止自由硫醇的質子化作用影響二硫鍵的正確配對，實驗結果表明：當復性緩沖液pH值為7.5左右時(圖4)，離心上清中的復性蛋白比活最高.

圖4 不同pH值對復性效果的影響曲線

2) 不同初始復性蛋白質量濃度對復性效果的影響

采用稀釋法復性，需要確定最佳初始蛋白質量濃度，蛋白質量濃度過高會增加分子間相互碰撞的幾率，使蛋白更容易發生聚集.實驗結果表明：當初始復性蛋白質量濃度為0.1～0.15 mg/mL左右時(圖5)，離心上清中的復性蛋白比活最高.

圖5 不同初始復性蛋白質量濃度對復性效果的影響曲線

3) 不同濃度比例的GSSG和GSH對復性效果的影響

包涵體變性時，蛋白中的二硫鍵被DTT完全打開，復性時，需要一定的氧化劑將其重新氧化，同時還需要一定的還原劑對錯配的和不穩定的二硫鍵重新還原，這兩個過程的有機結合才能得到較好的復性效果.本實驗采用適當比例的GSSG和GSH來提供所需的氧化還原環境，最終確定復性液中GSSG濃度為1 mmol/L，GSH濃度為3 mmol/L最為合適(圖6)，離心上清中的復性蛋白比活最高.

圖6 不同濃度比例的GSSG和GSH對復性效果的影響曲線

4) 不同時間對復性效果的影響

蛋白復性是一個緩慢的過程，需要充足的時間做保證，實驗結果表明：融合蛋白在復性24 h后，復性率趨于不變(圖7).

圖7 不同時間對復性效果的影響曲線

5) 復性后融合蛋白的分析鑒定

確定最佳復性條件為復性緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L β-巰基乙醇，0.5 mol/L尿素，0.5 mol/L精氨酸，1 mmol/L GSSG和3 mmol/L GSH，pH 7.5)，蛋白的初始復性質量濃度為0.13 mg/mL，4 ℃復性24 h.

8% SDS-PAGE電泳顯示復性后融合蛋白約為75 kD大小(圖8).

M-Protein Marker；1-復性后融合蛋白

為了驗證復性后的融合蛋白是否具有HSV-2抗原結合活性，本實驗用直接ELISA法鑒定復性液檢測抗原的活性.結果表明：復性后的融合蛋白不僅能識別特異性抗原還能有效顯示酶活性，證明了該融合蛋白具有融合前兩個分子的雙重功能.ELISA結果見圖9.

1-空白對照；2，3，4-三組平行ELISA

3 結 論

單鏈抗體分子量小，結構簡單，易于與各種分子融合形成多重功能的融合蛋白.堿性磷酸酶是廣泛應用于生物技術中的一種標記酶.常規的酶標二抗采用化學交聯方法制備，存在步驟繁瑣、標記率低、成本高的弊端.使用基因工程技術將識別單元和顯示單元融合表達制備出具有雙重功能活性的融合蛋白，這不僅省略了酶標抗體的制備過程，而且還可以使檢測過程更加簡單快速[7-8].我們構建了含有抗HSV-2單鏈抗體基因和堿性磷酸酶基因的融合表達載體并在大腸桿菌中獲得了包涵體形式為主的融合蛋白表達，包涵體經過兩步變性法[9]變性，再用鎳離子金屬螯合層析純化，最后初步探索了影響這種融合蛋白復性的因素，為今后產業化生產相關診斷試劑打下了一定的基礎.實驗結果證明：大腸桿菌可以有效地表達單鏈抗體和堿性磷酸酶融合蛋白，這種融合蛋白經過復性可以恢復原有兩個蛋白的各自生物學活性.堿性磷酸酶還可以作為復性的指示劑，通過檢測它的活性可以評估其融合伴侶是否也得以復性.該雙重功能活性的融合蛋白可應用于快速免疫篩查，使ELISA不再需要酶標二抗，簡化了ELISA步驟、縮短了檢測的時間、省下了常規化學交聯制備酶標二抗的成本，具有一定的應用前景.

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