動脈粥樣硬化“痰瘀”演變的內在機制研究*

★ 喻松仁 周麗 周步高 艾志福 程紹民 曹陽 袁肇凱

(1.江西中醫藥大學 江西 南昌 330004；2.湖南中醫藥大學 湖南 長沙 410007)

已有研究表明，AS(atherosclerosis,AS)屬中醫“痰濁”、“瘀血”范疇，“痰凝”、“血瘀”是其主要病理改變，應用“痰瘀相關理論”可闡釋AS形成發展機制[1]。但AS痰瘀演變的形成機理和物質基礎如何，對此并不十分清楚。故筆者采用維生素D3復合高脂飼養復制大鼠AS模型，通過動態觀察血脂、血液流變學、形態學和脂質代謝相關通路基因表達等的變化，探討AS“痰瘀”的演變規律?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雌性和雄性SD大鼠各28只，共56只，體重250±20g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK(湘)2009-0004。

1.1.2 主要試劑 膽固醇購自安徽天啟化工科技有限公司；丙基硫氧嘧啶購自南通精華制藥有限公司；維生素D3針劑購自哈爾濱宏達動物藥品廠；RT試劑盒購自TAKARA公司；Trans Ex Taq PreMix購自Trans公司；Trizol購自Trans公司；DEPC購自Amresco公司；引物源自Invitrogen公司；瓊脂糖購自Promega公司；溴化乙錠(EB)購自Sigma公司；6×Loading Buffer購自Takara公司；Trans DNA MarkerⅠ購自Trans公司；血脂試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司。白糖、豬油購于市場；基礎飼料由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。

1.1.3 主要儀器與設備 XY3000BF精密電子天平，常州市幸運電子設備有限公司；thermo冷凍高速離心機，德國thermo公司；SA-5600型全自動血流變分析儀，北京賽科希德科技發展有限公司；HITACHI7020全自動生化分析儀，日本；Leica RM2255石蠟切片機，德國萊卡儀器有限公司LEICA；PCR儀，德國eppendorf公司；電泳儀及電泳槽，北京六一公司；Js-380自動凝膠圖像分析儀，上海培清科技有限公司；DM2000生物顯微鏡，德國萊卡儀器有限公司；Leica DFC425C-數碼攝像頭，德國萊卡儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物造模和分組 參照文獻[2]方法造模，其飼料配制為：3.5%膽固醇、10%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.1%膽酸鈉、5%奶粉、5%花生、7%蔗糖、5%蛋黃粉、64.2%基礎飼料(主要包括面粉、米粉、玉米、麩皮、豆料等)，攪勻后制成高脂飼料。將實驗大鼠隨機分為正常組16只，造模組40只，正常組用普通飼料喂養，造模組用高脂飼料喂養。模型組在高脂飼料喂養的第1天腹腔注射維生素D3針劑(70×105u/kg體重)，喂養后的第14天腹腔注射維生素D3針劑(10×105u/kg體重)。以動物出現血脂增高作為“痰凝心脈證”，以血脂增高和血液流變學異常作為“痰瘀痹阻證”，以主動脈的形態學改變作為AS造模成功的標準。

1.2.2 取材和檢測 飼喂高脂飼料，分別于3、7、10、13周隨機處死大鼠，每次處死10只造模組大鼠及4只正常組大鼠。心臟采血，采血量約為7～9mL，分成2份，分別測血脂(LDL用Friedewald公式計算)、血液流變學指標。然后從主動脈弓處剪取1cm長一段，置于10%的甲醛溶液中固定后，各取組織塊逐級酒精脫水，石蠟包埋，常規連續切片(厚約5μm)，行Gill蘇木素．伊紅(HE)染色，鏡下觀察。同時截取0.5cm長的一段主動脈，100mg肝組織左葉，剝外膜，在生理鹽水中漂洗2次，投入液氮中；Trizol法抽提總RNA，DNase I處理后，采用紫外分光光度計測定其濃度，取1μg總RNA，以Oligo(dT)18為引物、M-MLV為逆轉錄酶進行逆轉錄反應，參照GenBank中靶基因mRNA的序列設計引物(基因引物設計如下)，靶基因和內參分別在最佳條件下及PCR循環的線性期內擴增，瓊脂糖凝膠電泳分析．采用Image Pro Plus version 5.0軟件分析電泳條帶灰度，與β-action灰度測定比值代表其mRNA表達的相對水平。

實驗目的基因引物設計：(1)PPARγ：上游引物5'ATTCTGGCCCACCAACTTCGG 3'，下游引物5'TGGAAGCCTGATGCTTTATCCCC 3'可擴增長339bp的cDNA片段；(2)INSIGN2：上游引物5' CCTAAAAAGCGTGGCCCCTA 3'，下游引物5' TGGCTCTCCTAGATGCCTGT 3'可擴增長264 bp的cDNA片段；(3)SCAP：上游引物5'CCGGGTCAGCCATACATTTG 3'，下游引物5'CCAGGTCCTGCTGAATGGAGT'可擴增長149bp的cDNA片段；(4)SREBP2：上游引物5'TGCATGAAGCAACTGTTCGAC 3'，下游引物5'CCGTGTTTGGTGTTCTGAGTG'可擴增長106bp的cDNA片段；(5)內參照：根據其各自片段大小的差異，分別選用207bp或484bp作為β-actin內參照：序列是207bpβ-actin：上游引物5' CACCCGCGAGTACAACCTTC 3'，下游引物5' CCCATACCCACCATCACACC 3'；序列是484bpβ-actin：上游引物5' AGAGGGAAATCGTGCGTGACATT3'，下游引物5' CCGGACTCATCGTACTCCTGCTT 3'。

2 研究結果

2.1 AS大鼠痰瘀演變與血脂的動態觀察 結果見表1。

從表1可知，正常組各模型周期血脂指標無顯著差異；在造模的第3周脂質代謝紊亂明顯，說明“痰凝”的病例模型已經形成，這與相關文獻報道一致[3]，隨著造模時間的延長，各模型周期TC、TG、LDL逐漸升高、HDL逐漸降低(P<0.01或P<0.05)，映證了TC、TG、LDL逐漸升高、HDL逐漸降低是AS痰濁的主要特征和生化物質基礎[4]，并提示“痰濁”量變貫穿于AS發生、發展和變化的整個病理過程，是本病遷延不愈、變證叢生的關鍵因素。

2.2 AS大鼠痰瘀演變與血液流變學的動態觀察 結果見表2。

從表2可知，正常組大鼠各模型周期血液流變學的檢測值無顯著差異；隨著造模時間的延長，TC、LDL、TG值的升高，造模大鼠各模型周期血液流變學改變呈升高趨勢，血行瘀滯不斷加重，尤其是造模第10與第13周比較有顯著改變，其中全血高切、中切和血漿粘度具有顯著差異(P<0.01或P<0.05)，表明隨著血中之痰濁(脂質代謝異常)不斷積聚，勢必誘使“瘀”的形成，亦即“痰可致瘀”。亦說明“瘀”是痰濁深入發展的必然產物。結果也提示了“痰瘀痹阻”階段的大鼠模型已經形成。

表1 AS大鼠“痰瘀”演變與血脂的變化

注：1.與正常組比較，**P<0.01，*P<0.05。2.模型組方差分析，##P<0.01,#P<0.05；3.模型7W與模型3W比較：○○P<0.01，○P<0.05；模型10W與模型7W比較：rrP<0.01，rP<0.05；模型13W與模型10W比較：ppP<0.01，pP<0.05。

表2 AS大鼠“痰瘀”演變與血液流變學的變化

注：同表1所注。

表3 AS大鼠“痰瘀”演變與PPAR、INSIG2、SCAP、SREBP2的變化

注：同表1所注。

圖1 正常AS HE 20×10；圖2 模型3周AS HE 20×10；圖3 模型7周AS HE 20×10；圖4 模型10周AS HE 20×10；圖5 模型13周AS HE 20×10

2.3 AS大鼠痰瘀演變與病理組織學的動態觀察 正常組大鼠動脈內皮細胞完整，單層緊貼內彈力板，中層平滑肌細胞排列整齊(見圖1)；造模第3周見動脈管壁內皮細胞部分脫落，平滑肌細胞排列疏松(見圖2)；造模第7周見動脈管壁輕度增厚，內膜下見少許泡沫細胞增生(見圖3)；造模第10周可見動脈管壁部分區域增厚，增厚處內膜、中膜可見泡沫細胞，部分區域見纖維組織的增生(見圖4)；造模第13周見動脈管壁全周增厚較明顯，管壁厚度不均勻，內膜管腔面見纖維組織增生形成纖維帽，其下見大量泡沫細胞沉積并伴有淡紅染無定型物質的形成(見圖5)。說明AS模型已經形成，且隨著痰瘀的演變主動脈損傷逐漸加重。

2.4 AS大鼠痰瘀演變大鼠與脂質代謝相關通路基因表達的動態觀察 見表3。

圖1 AS大鼠痰瘀演變PPARγ mRNA表達電泳圖

圖2 AS大鼠痰瘀演變INSIG2 mRNA表達電泳圖

圖3 AS大鼠痰瘀演變SCAP mRNA表達電泳圖

圖4 AS大鼠痰瘀演變SREBP2 mRNA表達電泳圖

從表3和圖6-9可知，正常組各模型周期PPAR mRNA、INSIG2 mRNA、SCAP mRNA和SREBP2 mRNA的表達量無顯著差異；AS各模型周期PPARγ mRNA、INSIG2 mRNA、SCAP mRNA的表達量隨著造模時間的延長而逐漸增加，且PPARγ mRNA表達量在各模型周期間比較均具有顯著差異(P<0.01)，INSIG2 mRNA表達量在第3周與7周、第10周與13周間比較存在顯著性差異(P<0.01或P<0.05)，SCAP mRNA表達在第7周與10周間比較差異明顯(P<0.05)。說明AS“痰瘀”病理演變過程中PPARγ mRNA、INSIG2 mRNA、SCAP mRNA表達量總體上有上調的趨勢；各模型周期SREBP2 mRNA的表達量隨著造模時間的延長而逐漸下降，存在顯著性差異(P<0.01)，說明AS“痰瘀”病理演變過程中SREBP2 mRNA表達量有下調的趨勢。

3 討論

從血脂等生化指標的改變來看，脂質代謝異常貫穿于冠心病痰瘀病理改變的始末，而血液流變學改變在造模后期表現得更為顯著。故而結合文獻研究，認為脂質代謝異常是“痰濁”產生的主要特征和物質基礎，是AS發生的始動因素，并貫穿痰瘀演變的始末；血液流變學改變是痰瘀演變的客觀指征，是AS繼發性改變，并非冠心病的始動環節。隨著血脂改變而引發血液流變學變化，AS因“痰”而致“痰瘀”的演變也在逐漸形成，病情也在逐漸加重。

從病理組織學來看，由正常到“痰瘀”的形成，動脈病變也更為嚴重，除了管壁內皮細胞部分脫落、平滑肌細胞排列疏松和泡沫細胞增生外，進一步發展而見內膜管腔面纖維組織增生，并形成纖維帽，且其下見多量泡沫細胞沉積和淡紅染無定型物質。如此則血管彈性下降，脆硬度增加，進而影響動脈血管的正常功能，也證實了高脂誘導的脂質代謝的紊亂會造成AS病理改變，且隨痰瘀演變的遷移而逐漸加重。

從分子水平來看，運用RT-PCR法動態觀察脂質代謝相關通路基因的表達，發現PPAR mRNA、INSIG2 mRNA、SCAP mRNA表達量隨著由“痰”致“瘀”的演變而呈上調趨勢，而SREBP2 mRNA的表達量則呈下降趨勢。痰瘀演變過程中，SREBP2 mRNA表達水平的降低，有利于反饋調節減少內源性膽固醇的生物合成，從而緩解外周血脂代謝紊亂狀況[5]；而SCAP mRNA和INSIG2 mRNA表達水平顯著升高，有利于形成SREBP-SCAP-INSIG復合體，將SREBP2錨定在內質網上，抑制其對下游基因的轉錄調控[6,7]。近年來，研究表明INSIG、SCAP、SREBPs代謝通路在保持細胞內膽固醇和脂肪酸的代謝平衡中起著重要的調節作用[8-11]；同時，在高脂血癥形成過程中PPARγ mRNA在血管壁細胞中出現不同程度的表達，這有利于控制動脈粥樣硬化斑塊的脂肪代謝[7]。故脂質代謝相關通路基因的異常表達是可能是AS“痰瘀”病理演變的分子機制。由于脂質代謝通路基因表達的增強或減弱，在它們表達產物的共同作用下，引發脂質代謝紊亂等復雜病理變化，最終形成動脈粥樣硬化，即由產物“痰濁”的量變過程而漸進為“痰瘀痹阻”。這些通路基因表達的改變，為我們有效地辨識“痰瘀”提供了分子生物學基礎。

總之，從本項目研究結果來看，AS痰瘀演變與脂質代謝密切相關，脂質代謝通路相關基因的表達的增強或減弱可能是AS“痰瘀”衍變發生的內在機制。

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