黃芪注射液對實驗性腦出血大鼠神經功能的影響

夏明武 秦 勇 許 浩 胡光民

(合肥市第二人民醫院神經內科，安徽 合肥 230038)

我國自發性腦出血(ICH)患者占全部腦卒中患者的30%左右，急性期病死率約為30%～40%。中藥黃芪是常用的益氣活血藥，近年來被用于腦出血的治療，有一定效果，但其具體的作用機制尚不明確。本研究觀察黃芪注射液對腦出血大鼠神經功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠48只，體重250～300 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供(編號0001956)。

1.2藥物與試劑 黃芪注射液：正大青春寶業有限公司，國藥準字Z33020179 10 ml/支；CD34抗體：購自Santa Cruz Biotechnology公司，產品編號 sc-7324；兔抗微管相關蛋白2(MAP-2)多克隆抗體：購自美國Sigma-Aldrich公司，產品編號M3696；SABC免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒：購自武漢博士德生物試劑公司。

1.3方法

1.3.1動物的處理及取材 48只SD大鼠隨機分為模型組和黃芪治療組，每組24只。術后1 h開始給藥，黃芪治療組于造模后1 h開始腹腔注射黃芪注射液(10 ml/kg-1/d-1)。模型組給予等量的生理鹽水腹腔注射，均為連續7 d。術后第7天和第14天在兩組中分別取12只大鼠進行神經行為學評分，然后10%的水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，腹主動脈取血2 ml，入抗凝管，立即送安徽醫科大學，流式細胞儀檢測外周血CD34+細胞的含量；經左心室至主動脈4%多聚甲醛溶液(4℃)灌注取腦，脫水，石蠟包埋。

1.3.2大鼠分組及腦出血模型的制備 參考大鼠腦立體定位圖譜以Yang等〔1〕方法造模，10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射，將大鼠麻醉固定在立體定位儀上，在前囟前0.2 mm，矢狀縫向右旁開3.0 mm，處顱骨鉆孔。取0.1 ml尾動脈血，以顱骨外板高度為零點將頭皮針刺入腦內，進針深度為6 mm。將75 μl自體不凝血(肝素抗凝)緩慢注入基底節區，留針10 min后緩慢拔針，手術部位消毒后縫合皮膚，放回籠中喂養。術后根據Berderson等〔2〕評分標準：無神經功能缺損0分；注射對側前爪不能伸直1分；出現轉圈現象2分；行走時身體向對側傾倒3分；無反應，完全不能行走4分。神經癥狀1～3分為造模成功。

1.3.3神經行為學評價 通過觸須誘發大鼠前肢放置實驗測試神經行為學，每只大鼠每個前肢重復刺激10次，記錄觸須刺激后前肢放置于工作臺面的次數所占百分數。

1.3.4免疫組織化學染色 腦組織石蠟切片，常規脫蠟至水，采用SABC法行MAP-2免疫組化染色，檢測免疫陽性細胞，嚴格按照試劑盒說明書操作。用Image-Pro Plus 5.0進行圖像分析，400倍鏡下視野測量MAP-2表達的平均光密度值(MOD)。每例標本取4張片子，每張片子出血區周圍隨機取5個視野，取平均值。所用MOD值采集均在相同光學和光鏡條件。

2 結 果

2.1神經功能評分 在前肢放置實驗中，黃芪治療組在第7天及第14天的神經功能評分(0.398±0.071，0.638±0.023)明顯高于同時間點模型組的評分(0.168±0.066,0.326±0.047)(P<0.05)，且同組中第14天的神經功能評分高于第7天時的評分(P<0.05)，表明腦出血大鼠經用黃芪治療后可以促進神經功能的恢復，并隨著時間的推移，恢復效果也明顯。

2.2外周血CD34+細胞含量的比較 用CD34+細胞占動脈血有核細胞百分比表示。黃芪治療組第7、14天外周血CD34+細胞含量(0.199±0.112)、(0.153±0.038)〕明顯高于同時間點的模型組〔(0.074±0.028)、(0.030±0.057)%〕(P<0.05)，同組中第14天的外周血 CD34+細胞含量低于第7天時的含量(P<0.05)，表明黃芪對內源性骨髓干細胞有動員作用，動員作用隨著時間的推移而下降。

2.3MAP-2蛋白表達比較 黃芪治療組第7、14天的MAP-2蛋白表達水平(0.193±0.038、0.240±0.112)高于同時間點模型組(0.080±0.017、0.124±0.028)(P<0.05)，同組中第14天的MAP-2蛋白表達水平高于第7天的表達水平(P<0.05)。表明腦出血大鼠經用黃芪治療后可以促進血腫周圍MAP-2蛋白的表達，且隨著時間的推移腦出血血腫中心MAP-2蛋白表達水平增高。圖1。

術后7 d模型組 術后7 d黃芪治療組 術后14 d模型組 術后14 d黃芪治療組

3 討 論

自發性腦出血可導致神經元的急性損傷和壞死，從而導致不同程度的神經功能障礙。近年來內源性干細胞的動員成為重塑受損神經網絡的重要途徑之一，骨髓中含有骨髓造血干細胞和骨髓間質干細胞兩大類干細胞，骨髓造血干細胞主要分化成各種血細胞；骨髓間質干細胞能產生表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、神經生長因子、腦源性神經營養因子及血管內皮生長因子等，具有轉化成神經細胞的能力〔3〕。Mezey等〔4，5〕研究認為，骨髓間質干細胞能夠遷移到受損的腦組織區域并分化成不同的腦組織細胞，以修復受損腦組織，從而起到神經修復和功能康復作用。

來源于骨髓造血干/祖細胞的CD34抗原具有黏附、加速血管前內皮細胞聚集形成血管的功能，CD34抗原的表達隨著細胞的成熟會逐漸逐漸減弱至消失〔6〕。所以，外周血CD34+細胞數可以間接評價外周血干細胞含量，同時CD34+細胞也是內皮前體細胞的來源，CD34+細胞的水平可以反映血管內皮功能變化，CD34抗原可作為檢測新生血管的標志性抗原。本文說明黃芪可以骨髓干細胞入血。CD34+細胞在體內能遷移到缺血部位參與新生血管形成及血管內皮的修復，改善微循環，促進血流恢復和神經再生〔3〕。

微管相關蛋白2(MAP-2)主要表達在神經元胞體內微管及樹突上〔7〕，參與神經元的生長和損傷后修復過程〔8〕，被認為是 研究神經再塑的分子標志物。本研究結果顯示，模型組血腫周邊只有少量MAP-2表達，而黃芪治療組血腫周邊MAP-2表達增強，表明通過黃芪的治療作用血腫周邊的神經軸突和樹突增生相對活躍，出現了神經細胞的修復和再生。

腦出血造成的病理性損傷主要包括出血對腦實質的機械性破壞，繼發腦缺血、腦水腫、炎癥及細胞凋亡等〔9〕。黃芪注射液對腦出血的神經功能保護作用的機制可能是：①抑制炎性細胞分泌〔10〕，減輕腦水腫，起到神經保護的作用。②減少腦出血灶早期神經元細胞內細胞色素C的釋放及提高Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶的活性，從而減輕腦出血灶區神經細胞的凋亡〔11〕。③擴張血管、降低周圍血管阻力，改善微循環〔12〕；降低血腦屏障的通透性〔10〕，減輕腦水腫。④抑制腦出血急性期星形膠質細胞的過度活化和GFAP的過度表達，從而有利于腦出血損傷后神經功能的恢復〔9〕。

本實驗發現，黃芪注射液可以明顯改善腦出血大鼠的神經功能，其作用機制可能是動員足量的骨髓間質干細胞遷移至腦出血區及周邊，促進新生血管形成及血管內皮的修復血管，促進神經的再生修復和神經功能的恢復。

4 參考文獻

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