LOX基因對人絨癌Bewo細胞侵襲轉移的影響及意義

王 璟 郭 影 趙向寨 李 萍

(河北醫科大學第三醫院，河北 石家莊 050051)

妊娠滋養細胞腫瘤(GTN)包括侵蝕性葡萄胎、絨毛膜癌、胎盤部位滋養細胞腫瘤，是來源于異常滋養細胞的腫瘤，多發于生育期婦女〔1〕。賴氨酰氧化酶(LOX)主要調節細胞外基質，包括5個成員，其中LOX定位于5q23.3～31.2，是腫瘤發生侵襲、轉移的密切相關基因〔2，3〕。本研究采用RNA干擾技術，靶向構建LOX小干擾RNA(siRNA)，轉染人絨癌Bewo細胞，敲低LOX基因表達，探討對人絨癌Bewo細胞的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人絨癌Bewo購于中國科學院上海細胞庫，DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自GIBCO公司；LOX siRNA、Control siRNA-A、siRNA轉染試劑購自Santa Cruz公司；LOX、N-cadherin,基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-7抗體均購自Santa Cruz公司。

1.2細胞培養 人絨癌Bewo細胞株由中國科學院上海細胞庫提供，細胞經10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素DMEM培養基培養，37℃、5%CO2飽和度和濕度恒溫培養箱中孵育。0.25%胰蛋白酶消化細胞傳代，取對數生長期細胞。胰酶消化細胞計數，稀釋細胞，使細胞密度為4×105個/ml，鋪于無菌6孔培養板中，培養12 h至人絨癌Bewo細胞融合率達50%，棄去原細胞培養液，換無血清、無抗生素DMEM培養液，按轉染試劑盒說明書要求用Transfection regent稀釋LOX siRNA、Control siRNA及轉染試劑Transfection medium/regent。實驗分組：正常培養人絨癌Bewo細胞組(對照組，Control)、轉染LOX siRNA細胞組(Mock)、轉染Control siRNA細胞組(siRNA)。轉染試劑作用6 h，無血清培養基沖洗細胞，換含10%血清、抗生素培養基繼續培養。于轉染24 h后，分別搜集細胞提取總RNA及總蛋白待測。

1.3實時定量PCR檢測各蛋白 mRNA水平表達 轉染后24 h，提取總RNA，測定A260/A280值介于1.8～2.0。以β-actin作為內參，總RNA 濃度為1 mg/ml進行逆轉錄，將cDNA為模版進行PCR反應，PCR反應條件：預變性95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，目的基因30個循環，內參循環數設定為25個循環。擴增完畢，溶解曲線進行分析，以β-actin為內參，利用CT值計算各組LOX mRNA相對值。用2-△△CT表示。各目的基因引物序列LOX：5′-TTACTCTCCATGGTGGTGCC-3′,5′-AGCTTCTTCTGCTTGTTGCC-3′；N-cadherin：5′-CAACTTGCCAGAAAA-CTCCAGG-3′,5′-ATGAAACCGGGCTATCTGCTC-3′；MMP-2：5′- CTATTCTGCCAGCACTTTGG -3′,5′- CAGACTTTGGTTCTCCAA-CTT -3′；MMP-7：5′-TGGGAACAGGCTCAGGACTATCT-3′,5′-TTCGGGTCTACACCTCACGG-3′；GAPDH ：正義5′-GTACGTCG-TGGAGTCCACTG-3′,反義5′-TCCACCACCCTG TTGCTGTA-3′。

1.4Western印跡法檢測各目的基因蛋白水平表達 經過 24 h轉染后，分別提取各組細胞，給予預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，于冰上進行操作，細胞裂解液裂解細胞，提取蛋白，二喹林甲酸(BCA)法蛋白定量，各組取等量細胞總蛋白于12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，半干法轉至NC膜，含5%脫脂奶粉TBS室溫封閉1 h， LOX(兔抗1∶500，SANTA CRUZ)N-cadherin(兔抗1∶250，SANTA CRUZ)、MMP-2(鼠抗1∶500，SANTA CRUZ)、MMP-7(鼠抗1∶300，SANTA CRUZ)和GAPDH(兔抗1∶2 000，Abcam)，4℃過夜；二抗(羊抗鼠或羊抗兔1∶2 000)37℃ 1.5 h；增強化學發光法(ECL)顯色 ，凝膠成像系統掃描分析。

1.5Transwell實驗 將給予siRNA處理后細胞含血清100 ml/L的DMEM培養基懸浮，以2×105接種于Fibronectin包被的Transwell孔板其中的12個Transwell上，上室加入100 μl/孔，下室加入600 μl含血清200 ml/L的DMEM培養基。 經過24 h后，取出上室，用棉簽蘸去上層的細胞，加入100 ml/L新鮮配置的甲醛溶液固定30 min，然后用SyTOXGreen染色15 min。甘油封片后用熒光顯微鏡檢測細胞通過情況。平均每小時計數5個視野，取平均值分析細胞的穿透能力。

2 結 果

2.1LOX siRNA 轉染后目的基因在蛋白及mRNA水平的表達 轉染LOX siRNA 24 h后LOX 表達明顯降低，約為對照組的(36±1.3)%，在mRNA水平明顯降低約為對照組的(41±2.1)% ，見圖1。

圖1 各組目的基因蛋白表達情況

2.2LOX siRNA轉染后細胞N-cadherin、MMP-2、MMP-7蛋白及mRNA水平表達 轉染LOX siRNA 24 h后N-cadherin、MMP-2、MMP-7 表達明顯降低，分別約為對照組的(35±2.6)%，(29±0.8)%，(42±1.7)%。在mRNA水平表達明顯降低，結果以2-△△CT表示，分別為 0.34±0.213，0.30±0.064，0.45±0.301。見圖2。

A:蛋白表達;B:mRNA表達

2.3Transwell檢測細胞遷移能力的改變 轉染后24 h，siRNA組穿膜細胞為(41±5)個，Mock組和Control組分別為(154±6)和(167±5)個，與Mock組和Control組比較，siRNA組穿膜細胞數明顯減少(P<0.05)。而Mock組和Control組穿膜細胞數比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 Transwell檢測細胞遷移能力

3 討 論

LOX在多種腫瘤中高表達，其中乳腺癌的研究中發現LOX過表達可以改變腫瘤細胞外基質的結構，激活特定通路，上調MMPs類的表達，從而降解基底膜，使得內皮細胞侵襲、遷移，出現新生血管，加速乳腺癌轉移侵襲〔4〕。細胞外基質膠原和彈力蛋白聚合最初階段的關鍵酶及細胞外基質形成修復關鍵因子均是LOX〔5,6〕，同時研究〔7〕發現干擾LOX可以有效抑制腫瘤細胞侵襲、轉移。人絨毛膜癌臨床特點具有轉移早、侵襲性強，但機制不明，本研究說明MMPs與腫瘤侵襲、轉移關系密切，侵襲轉移主要通過降解細胞外基質〔8,9〕。

綜上，沉默LOX在人絨癌Bewo中的表達，可明顯降低人絨癌Bewo細胞侵襲、轉移能力，為人絨毛膜癌基因治療提供實驗基礎。

4 參考文獻

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