苯并異噻唑啉酮甲酸酯類衍生物的海洋防污性能研究

魏 婕，王旭裕，王向輝，林 強，王愛民，楊建新

(1.海南大學熱帶生物資源教育部重點實驗室;海南省精細化工工程技術研究中心;海南大學材料與化工學院，海南?？?70228;2.海南師范大學化學與化工學院，海南?？?71158)

近年來，生物污損問題已嚴重制約了海洋資源與能源的開發利用.海洋污損生物也稱海洋附著生物，是生長在船底和海洋固定設施表面的動物、植物和微生物［1］.海洋污損會堵塞水下管道;損壞儀器設備;加速金屬表面腐蝕.被污損生物大量附著的船舶往往自重增加、船體底面粗糙度增大、航速降低、油耗增加，迫使船舶頻繁整修，故防污問題受到了人們的極大關注［2－4］.

在眾多防污方法中，涂覆防污涂料是最為經濟、便捷的方法.其主要作用機理是通過漆膜中防污劑的逐步滲出，抑制海洋污損生物附著生長，以達到防止海洋生物污損的目的.早期傳統防污涂料以Cu2O為主要成份，其毒劑大量富集在生物體內，并通過食物鏈進入人體，進而對人類健康造成威脅.20世紀70年代開發的有機錫防污涂料具有較強的毒性，即使百億分之幾的濃度也足以造成海洋生物的畸形，因此，該涂料在2008年被全面禁用.為此，異噻唑啉酮類衍生物被作為殺菌劑而應用于許多行業，尤其是作為綠色防污劑而得到了廣泛認可［5－6］.此類化合物具有抑菌能力強、應用計量小、普適、低毒等優點，它對于促進海洋資源與能源的開發利用以及保護海洋的生態環境具重大的意義.

由于藤壺具有較強的繁殖能力和廣泛的分布，因此它已成為最主要的海洋污損生物之一.目前，許多國內外學者把藤壺作為防治海洋生物污損的重要研究對象［7－8］.Sasikumar等人對多種海洋常見的污損動物進行了測試，分析了它們對石油、重金屬、碳水化合物、清潔劑及多種有機化合物的敏感性，通過比較認為藤壺幼蟲最適宜作為防污實驗的材料［9］.

在此前工作中，筆者設計合成了一系列苯并異噻唑啉酮類衍生物，并測試了這些化合物對細菌及真菌的抑制活性［10－13］.結果表明，合成的化合物對于細菌及真菌均有優良的抑制活性，具有進一步開發成為新型環保防污涂料的潛力.因此，本文在此前工作的基礎上，選取藤壺二期無節幼蟲為實驗對象，研究了2－(苯并異噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯類化合物對藤壺的毒性效應，并結合淺海掛板實驗，考察了其防污性能.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑 體視顯微鏡:北京泰克儀器有限公司;LED光源;培養皿;瓷磚(300 mm×150 mm×3 mm);網紋藤壺Ⅱ期無節幼蟲;新取海水;二甲基亞砜(分析純);B04－10白啞光丙烯酸磁漆(廣西北海市造漆廠);天那水(?？谑胁刍S).

1.2 合成實驗 2－(苯并異噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯類化合物是由固體三光氣、脂肪醇和苯并異噻唑啉酮(BIT)為原料而合成［14］，具體合成路線如下:

圖1 目標化合物合成路線

1.3 藤壺的生物活性實驗

1.3.1 成體藤壺的采集與幼蟲的繁殖 新取的海水經過濾、高壓滅菌備用.藤壺采自廢棄木船底部，并選擇個體較大的藤壺成體以便繁殖幼蟲.將采集好的藤壺清洗干凈，刷去表面淤泥和其他海洋生物，放入裝有新鮮海水的燒杯中，陽光照射刺激1 h后，可獲得大量藤壺一期和二期的無節幼蟲，培養3 h后，即可得到藤壺的二期無節幼體.根據藤壺幼蟲的趨光性，以LED燈作為光源，用滴管小心吸取趨光性良好的藤壺幼蟲，肉眼觀察，確定幼蟲個數，將其轉移到盛有新鮮海水的小燒杯中，控制其密度不超過5只/mL，供實驗用.

1.3.2 藤壺幼蟲急性毒性實驗 準確稱取2－(苯并異噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯類化合物10 mg，溶于10 mL DMSO中，用過濾滅菌后的新鮮海水稀釋，分別配制成質量濃度為5、4、3、2、1 mg/L的受試溶液，并設BIT、含等量濃度的DMSO溶液和海水作為對照組.每個化合物共8組實驗，每組均設3個平行樣.用滴管小心吸取藤壺幼蟲，用與各組實驗濃度相同的毒液潤洗后再放入培養皿中，確保實驗組藥物濃度的準確性.每個培養皿中藤壺二期無節幼蟲數為30只，分別在投入幼蟲12 h、24 h后用體視顯微鏡觀察，并記錄死亡幼蟲個數.實驗期間，避光加蓋、不投餌、不通氣.

實驗以國內外廣泛使用的“停止游動”現象作為判斷藤壺幼蟲死亡的標準.觀察時，輕搖培養皿，如果沉到培養皿底部的藤壺幼蟲停止游動和附肢停止振動(15秒以上)，則認為已經死亡，記錄后將確認死亡的幼蟲吸出［15］.

1.4 淺海掛板實驗 參照國家標準“淺海掛板試驗標準”(GB/T 5370—2007)進行海洋掛板實驗，對所制備的防污涂料的防污性能進行了考察［16］.

選取2－(苯并異噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯類化合物a、c、e、f進行淺海掛板實驗.根據油漆固含量將化合物配制成質量濃度為0.01%、0.05%和0.1%的防污涂料，并以BIT及空白樣板做對照組.實驗樣板采用瓷磚(300 mm×150 mm×3 mm)，以避免海水對材料表面腐蝕，從而消除了腐蝕干擾.用天那水做溶劑，以丙烯酸磁漆為成膜劑，配制不同質量濃度的防污涂料.瓷磚表面洗凈后，涂刷兩道自制防污涂料，室溫晾干至固化完全.實驗地點為海南省?？谑惺兰o大橋北端淺海，沿岸礁石附著有大量藻類、石灰蟲、網紋藤壺、牡蠣等污損生物.將實驗樣板做好顯著標識，固定于框架中，樣板浸海深度為1 m.

實驗板浸入淺海后，需定期檢查、記錄和拍照.觀察前小心清洗樣板，除去板上淤泥，并注意不得損壞防污漆膜;觀察后盡快將樣板放回原處，避免已附著生物死亡而影響實驗結果.最后，根據樣板表面的附著生物種類及數量評價防污性能.

2 結果與討論

2.1 藤壺幼蟲急性毒性實驗結果與分析 根據實驗所得的數據，分析各化合物對藤壺幼蟲的急性毒性效應.以受試化合物濃度為橫坐標，并以12 h以及24 h藤壺幼蟲的死亡率為縱坐標，分別作圖:

圖2 化合物對藤壺幼蟲的毒性效應（12 h）

圖3 化合物對藤壺幼蟲的毒性效應（24 h）

從上圖可以看出，當質量濃度達到5 mg/L時，各化合物對藤壺幼蟲均有一定的毒性作用，且毒殺效果均優于對照組BIT.從圖2(12 h)可看出，化合物c的質量濃度為1 mg/L時，藤壺的死亡率僅為1.1%，但質量濃度為4 mg/L時，其死亡率已達100%，也就是說，在1～4 mg/L之間，化合物c對藤壺的毒性效應急速增加.與之相比，24 h(圖3)時，當化合物e的質量濃度為1 mg/L，藤壺幼蟲的死亡率已超過75%，可見，化合物e質量濃度在0～1 mg/L之間時，藤壺幼蟲對其極為敏感，微量毒劑就已有明顯毒殺效果.此后，隨著質量濃度的繼續增加，死亡率緩慢上升.由此可以得出，藤壺幼蟲對不同化合物質量濃度區間的敏感性存在差異，毒性效應隨化合物質量濃度的增加呈兩種不同趨勢:毒性快速增強趨勢和毒性緩慢增加趨勢.就所有化合物而言，無論是12 h，還是24 h，隨化合物質量濃度的增加，藤壺幼蟲的死亡率均升高，各化合物對藤壺幼蟲的毒性效應增強.在相同實驗條件下，12 h的有效致死率均小于24 h的有效致死率，說明隨時間的推移，各化合物對藤壺的毒性作用不斷增強.

采用概率單位法計算藤壺二期無節幼蟲的半致死濃度(LC50)，將濃度換算成對數值，各濃度對應的死亡發生頻率換算成概率單位，通過化合物質量濃度對數和死亡概率單位的線性回歸，做回歸直線.當概率單位為5時，所對應的值即為LC50的對數，查詢反對數表，得各化合物對藤壺二期無節幼蟲的半致死濃度(LC50)［17］，數值見下表:

從表1可看出，所設計合成的6個苯并異噻唑啉酮類衍生物對藤壺幼蟲均有一定的毒性作用，且毒殺效果優于BIT.隨時間推移，毒性作用增加，24 h藤壺幼蟲LC50僅為12 h的一半左右.根據上表LC50數值可看出，隨化合物取代基中碳原子數目的增加，LC50逐漸減小，即殺死50%的藤壺幼蟲所需的化合物質量濃度逐漸降低.推測:受試化合物對藤壺的毒性作用與其結構存在一定的關系，碳原子數目增加，有利于毒性作用的增強.

表1 9種有機化合物對網紋藤壺Ⅱ期無節幼蟲的LC50

2.2 淺海掛板實驗結果與分析 基于以上實驗結果，選取LC50值有明顯差異的a、c、e、f 4個化合物進行淺海掛板實驗.以BIT以及空白樣板作為對照，根據油漆固含量配制質量濃度為0.01%、0.05%和0.1%的防污涂料.海洋掛板實驗90 d后，取出實驗板拍照，結果如圖4所示:

圖4 浸海實驗樣板照片

化合物a具有良好的防污性能，其質量濃度為0.01%(圖a－1)時，有少量藤壺附著.增加質量濃度到0.05%(圖a－2)時，僅有少量藻類沉積.當質量濃度達0.1%(圖a－3)時，板面光滑，未見任何污損生物附著.化合物c也具有優良的防污效果，浸海90 d后，實驗板表面少有污損生物附著，且防污性能隨其質量濃度的增加而增強.化合物e對海洋污損生物的抑制作用較好，其質量濃度為0.01%時(圖e－1)，有少量污損生物附著生長，當其質量濃度達0.1%(圖e－3)時，未發現污損生物，防污效果可達要求.化合物f的質量濃度低于0.05%(圖f－1、f－2)時，有較多藤壺附著，當增大質量濃度至0.1%(圖f－3)時，對污損生物有較好的抑制作用.對照組空白樣板(KB)以及化合物BIT樣板經過90 d的海水浸泡后，表面均出現了藤壺、牡蠣、石灰蟲等大量污損生物附著.

淺海掛板實驗表明:合成化合物取代基不同，對污損生物的抑制作用也不同，且防污性能隨化合物質量濃度的增加而提高，當質量濃度為0.1%時，少有污損生物附著，其90 d的防污效果基本可達要求.各化合物防污效果明顯優于空白樣板及同濃度下的BIT樣板，因此，2－(苯并異噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯類化合物比BIT具有更優良的防污性能，以上結論與藤壺急性毒性的實驗結果相符.

3 結論

本文研究了6個2－(苯并異噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯類化合物對藤壺二期無節幼蟲的急性毒性效應，并選取其中毒殺效果較好的4個化合物進行淺海掛板實驗.

藤壺毒性實驗表明:各化合物對藤壺幼蟲均具有一定的毒性作用，且毒殺效果隨化合物質量濃度的增加及作用時間的延長而提高.藤壺幼蟲對不同化合物質量濃度區間的敏感性存在差異.毒性效應隨化合物質量濃度的增加呈毒性快速增強的趨勢或毒性緩慢增加的趨勢.LC50數據表明，隨化合物取代基中碳原子數目的增加，LC50逐漸減小，毒性作用逐漸增強.

淺海掛板實驗表明:化合物的不同取代基對污損生物的抑制效果存在差異，其防污性能隨化合物質量濃度的增加而提高，質量濃度為0.1% 時，防污效果基本可達要求，與藤壺毒性實驗結果相一致，2－(苯并異噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯類化合物比BIT具有更優良的防污性能，有進一步開發成為新型海洋防污涂料的潛力.

致謝

感謝海南省精細化工工程中心，海南大學分析測試中心，海南大學海洋學院對本文的支持.

［1］黃宗國，蔡如星.海洋污損生物及其防除∶上冊［M］.北京:海洋出版社，1984.

［2］ABARZUA S，JAKUBOWSKI S.Biological investigation for the prevention of bio-fouling:Biological and biochemical principles for the prevention of bio-fouling［J］.Mar Ecol Prog Set，1995(123):301 －312.

［3］DAVISA R，TARGETTN M，MCCONNELLO J，et al.Epibiosis of marine algae and benthic invertebrates:natural products chemistry and other mechanisms inhibiting settlement and over-growth［J］.Bioorg Mar Chem，1989(3):86 －114.

［4］PEARCE F.Offshore petroleum:Bio-fouling problems and solutions［M］.Australia:The University of New South Wales，1994:19－31.

［5］DIEHL M，CHQPMAN J.Association of the biocide 5-chloro-2-methyl-isothiazol-3-one with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas fluorescens［J］.International Biodeterioration，1999，44(4):191 －199.

［6］于良民，姜曉輝，董磊，等.異噻唑啉酮類化合物及其在海洋防污涂料中的應用［J］.涂料工業，2004，34(5):43－47.

［7］黃英，柯才煥，周時強.國外對藤壺幼體附著的研究進展［J］.海洋科學，2001，25(3):30－32.

［8］田斌.海洋防污涂層生物性能的研究［D］.青島:中國海洋大學，2005.

［9］SASIKUMAR N，CLARE A S，GERHART D J.Comparative toxieities of selected compounds to nauplii of Balanus amphitrite Darwin and Artemia sp.［J］.Bulletin of Environmental Contamaination and Toxieology，1995，54(2):289 －296.

［10］王向輝，尹學瓊，馮文，等.N－取代苯基－2－(苯并異噻唑啉－3－酮 －2－基)甲酰胺的合成及抑菌活性［J］.農藥學學報 ，2012，14(2):225－228.

［11］賀永寧，袁文，王向輝，等.2－(N－苯基甲酰胺基)苯并異噻唑啉－3－酮基類化合物的合成及生物活性測試［J］.海南大學學報(自然科學版)，2007，25(4):345－348.

［12］王向輝，楊建新，林強.Synthesis，bioactivity and crystal structure analysis of N-(2-ethoxyphenyl)-3-oxobenzo［d］isothiazole-2(3H)-carboxamide［J］.Chinese Journal of Structural Chemistry，2012，3(15):758 －762.

［13］YANG Jianxin，YOU Chenghang，WANG Xianghui，et al.The synthesis and bioactivities of 2-hydroxyethyl benzoisothiazole-3(2H)-one marine antifouling paints［J］.Advanced Materials Research ，2013，646:24 －29.

［14］王向輝.苯并異噻唑啉酮類衍生物的設計合成及其抑菌活性［D］.?？?海南大學，2009.

［15］周永欣，章宗涉.水生生物毒性試驗方法［M］.第一版.北京:農業出版社，1989.

［16］中國國家標準化管理委員會.GB/T 5370—2007 G50涂料基礎標準與通用方法［S］.北京:中國標準出版社，2008.

［17］顧兵，張政，李玉萍，等.半數致死劑量及其計算方法概述［J］.中國職業醫學，2009，36(6):506－511.