水稻組蛋白單泛素化連接酶基因(OsHUB1)的克隆及其表達分析

劉云霄，向 鵬，羅紅麗

(海南大學海南省熱帶作物資源可持續利用重點實驗室，海南?？?70228)

組蛋白是染色體的結構蛋白，它能夠與DNA結合而形成核小體，是核小體的基本組成單位［1］.組蛋白可以發生多種修飾，包括乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化以及ADP核糖基化等［2］，這些共價修飾能夠通過改變DNA雙鏈與組蛋白的親和性來改變染色質構型，或者通過影響反式作用因子與啟動子的親和性來調控特定基因的表達.這些共價修飾之間存在協同和級聯效應，能夠通過多種修飾方式的組合發揮其調控功能，從而維持生物體的正常生長發育，并對不同生物和非生物的脅迫作出響應［3-5］.

組蛋白泛素化修飾包括多泛素化和單泛素化2種類型，其中單泛素化修飾多發生于組蛋白H2A和H2B上［6-10］.目前，在植物中只發現2個組蛋白H2B單泛素連接酶基因，即在擬南芥中與BRE1基因同源的AtHUB1和AtHUB2基因，它們的編碼產物都包含一個保守的RING指結構域，屬于RING型E3連接酶.這類蛋白廣泛參與調控植物的生長發育，在細胞分裂、生長、花期、光形態建設及種子休眠等方面發揮功能.研究發現，HUB1-1基因缺失突變體與野生型相比，其株型明顯變小、核內DNA量減少而復制增加、在DNA復制后期(G2)向分裂期(M)轉化的特異基因表達量降低，表明AtHUB1的缺失阻滯了HUB1-1突變體中細胞分裂由G2-to-M的轉化［11］.擬南芥FLC基因(Flowering Locus C)是重要的花期調控基因.研究發現，FLC基因所在的染色質組蛋白H2B能夠被AtHUB1進行單泛素化修飾，這種修飾可以促進H3組蛋白在K4和K36位點發生甲基化，進而激活FLC及相關基因的表達，導致植物表現晚花表型［12-14］.另有研究報道，擬南芥HUB1介導的H2B組蛋白單泛素化與種子休眠有關，當T-DNA插入突變體ΔHUB1中時休眠相關基因的表達受到了抑制，種子表現出休眠缺陷表型，而且該作用與ABA介導的信號途徑有關［15-16］;同時，擬南芥H2B組蛋白單泛素化修飾還參與了光形態建設和生物鐘的調節［17-18］.此外，擬南芥AtHUB1是腐生病原真菌防衛反應的調節組分，其功能缺失突變體ΔHUB1對腐生病原真菌Alternaria brassicicola和Botrytis cinerea表現出高度的感?。?9］.

本研究通過RT-PCR技術克隆了水稻中的一個RING型組蛋白H2B單泛素化連接酶基因OsHUB1，初步分析了該基因的結構和表達模式.研究表明:該基因的表達受到了植物激素SA和JA的誘導，它可能參與了植物中由SA和JA介導的信號途徑，這為進一步研究該基因的功能奠定了基礎.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 日本晴(Orazy sativa‘Nipponbare’)，

1.1.2 質粒和菌株 pGEM-T easy購自Promega公司，大腸桿菌感受態DH5α購自北京艾德生物科技有限公司.

1.1.3 試劑盒、工具酶及生化試劑 植物總RNA Trizol試劑盒、DNaseⅠ購自Invitrogen;反轉錄試劑盒、Pyrobest高保真酶購自TaKaRa公司;DNA回收試劑盒、Taq DNA Polymerase以及各種限制性內切酶和PCR相關試劑均來自NEB公司;引物合成由Invitrogen公司合成，測序由上海生工完成.

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 按照Invitrogen公司Trizol試劑盒說明書提取.

1.2.2 RT-PCR擴增OsHUB1基因 根據擬南芥HUB1(At2g44950)的堿基序列，通過Rice Genome Annotation Project BLAST Search進行Blastx在線比對，獲得水稻中同源基因的堿基序列(基因序列號:LOC_0s4g46450).根據該序列設計擴增OsHUB1基因開放閱讀框的特異性正向引物(OsHUB1-F:5＇-ATAGGATCCATGGGGAGCACGGGGGAGCCC-3＇)和 反 向 引 物 (OsHUB1-R:5＇-GCGGGTACCTATGTAGATAGGTTTCACGTC-3＇)，并按照反轉錄試劑盒的說明進行cDNA合成.以合成的cDNA為模板，進行PCR擴增.具體反應體系為:10×Pyrobest buffer(Mg2+plus)5 μL，基因特異性正向引物OsHUB1-F和反向引物Os-HUB1-R 各 1 μL，dNTP mix(2.5 mmol·L-1)4 μL，cDNA 1 μL，高保真酶(2.5 U·μL-1)0.5 μL，ddH2O 37.5 μL.PCR反應條件如下:95℃ 4 min;95℃ 35 s，55℃ 45 s，72℃ 4 min，共32個循環;72℃ 5 min.反應結束后，以w=1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果，隨后，待條帶回收后送往公司測序.

1.2.3 生物信息學分析 用DNASTAR軟件分析OsHUB1基因cDNA全長核苷酸序列和推測氨基酸序列;隨后在NCBI數據庫中將OsHUB1的氨基酸序列與Genebank中已經發布的氨基酸序列進行BLAST比對.不同物種的HUB蛋白氨基酸序列的同源性比對是利用Lasergene軟件完成的.

1.2.4 樣品處理 分別用濃度為0.1 mol·L-1的SA和JA噴灑于三葉期水稻幼苗的葉片表面，直到葉面均勻布滿霧滴為止，同樣，于對照植株上噴施無菌水.將激素處理后的水稻幼苗置于光照培養箱中繼續培養，溫度為(25±1)℃，光照周期為12 h，濕度為75%.

1.2.5 表達分析 在噴施SA、JA后，于不同時間點(0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、60 h)取水稻葉片，并按Trizol試劑盒的說明書提取總RNA，同時按DNaseⅠ說明書消化其中殘余的基因組DNA，然后取等量處理過的RNA并以其為模板進行cDNA的合成.PCR反應按以下條件進行:95℃ 4 min;95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共26個循環;72℃ 5 min.反應結束后于w=1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測.

2 結果與分析

2.1 水稻OsHUB1基因編碼區的擴增 采用RT-PCR擴增水稻OsHUB1基因編碼區全長cDNA，電泳檢測結果見圖1.在2 500～3 000 bp之間獲得一條特異性的亮帶，將該條帶回收測序，結果顯示該片段包含2 655個堿基對，是一個完整的開放閱讀框，其編碼產物為885個氨基酸的多肽，理論分子量為100.3 kD，理論等電點為7.785，屬于堿性蛋白(見圖2).

圖1 OsHUB1基因的全長擴增

圖2 OsHUB1核苷酸序列及其推測的氨基酸序列

2.2 OsHUB1的生物信息學分析 根據水稻數據庫序列信息，通過網站http://www.softberry.com對OsHUB1基因結構進行在線分析，結果顯示，OsHUB1基因全長7 803 bp，由18個內含子和17個外顯子組成(如圖3所示).通過http://smart.embl-heidelberg.de/help/smart_glossary.shtml網站對OsHUB1蛋白可能的結構域進行預測，結果表明，該蛋白C端有一高度保守的RING指結構域，N端存在一個低復雜度區域(Low compositional complexity regions，LCRs)和一個Coiled-Coil區(如圖4所示).

圖3 OsHUB1基因結構示意圖

圖4 OsHUB1蛋白結構域分析

將OsHUB1蛋白氨基酸序列在Genebank中與已經發布的氨基酸序列進行BLAST比對，發現OsHUB1蛋白與短柄草(Brachypodium distachyon)、楊樹(Populus tomentosa)、葡萄(Vitis vinifera)、大豆(Glycine max)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)的E3泛素連接酶分別具有78%，68%，68%，67%和62%的同源性.這些HUB1同源蛋白的C端均含有一個保守的RING指結構域，其中Cys-Xxx2-Cys-Xxx9-39-Cys-Xxx1-3-His-Xxx2-3-Cys/His-Xxx2-Cys-Xxx4-48-Cys-Xxx2-Cys分子結構模式高度保守，為該類E3泛素連接酶表現連接活性所必不可少的，其中Xxx代表任一氨基酸(如圖5所示).以上分析結果說明，所擴增的OsHUB1基因是水稻中的RING型E3泛素連接酶的同源基因.

圖5 不同植物來源的HUB1蛋白與OsHUB1蛋白RING-finger結構域氨基酸序列的同源性比較

2.3 不同信號分子處理水稻后OsHUB1的表達變化 SA和JA是植物抗病信號轉導中重要的信號分子［9-10］，它們所介導的植物抗病信號轉導途徑在植物防衛反應中發揮著關鍵的作用.為了探究水稻Os-HUB1基因與不同信號途徑的關系，筆者分析了SA和JA處理水稻幼苗不同時間后OsHUB1基因的表達變化情況，結果如圖6和圖7所示.實驗結果表明，在內參基因OsActin表達相同的條件下，SA處理水稻幼苗6 h時，OsHUB1基因的表達被明顯誘導，24 h后有所下降(見圖6);同樣，用JA處理水稻幼苗6 h也能夠明顯誘導OsHUB1基因的表達(見圖7).以上數據說明，OsHUB1基因對SA和JA都能夠產生應答，它可能參與了水稻中的SA和JA介導的抗病信號途徑.

圖6 SA處理水稻幼苗對OsHUB1表達的影響

圖7 JA處理水稻幼苗對OsHUB1表達的影響

3 討論

本研究克隆了水稻HUB1的同源基因OsHUB1，其開放閱讀框為2 655 bp，它編碼一個具有885個氨基酸殘基的多肽.氨基酸序列分析表明，該蛋白C端有一個典型的RING指結構域，屬于RING型泛素E3連接酶.在擬南芥中的研究表明，HUB1參與了植物對腐生病原真菌的防衛反應，并主要通過SA和JA信號途徑發揮作用［19］.本研究結果亦表明，水稻中SA和JA也可以誘導該基因的表達，這與擬南芥中的研究結果基本一致.但也可以看到，SA對OsHUB1基因表達的誘導作用在6 h和12 h時最強，之后明顯下降，這暗示:盡管OsHUB1基因同時參與SA和JA介導的信號途徑，但其依賴的上游信號組分并不相同.

從圖5的比對結果來看，盡管不同物種來源的HUB1蛋白的同源性不高，如水稻OsHUBI與擬南芥AtHUB1的同源性僅為62%，但其中的RING結構域卻十分保守.在生化功能方面，AtHUB1具有體外和體內的E3連接酶活性，可以特異性地催化組蛋白H2B的單泛素化修飾，其中的RING指結構域為單泛素化反應所必須.因此推測，水稻OsHUB1應該同樣具有E3連接酶活性，能夠對底物進行泛素化修飾.根據圖4顯示的結果，OsHUB1蛋白中除了RING指結構域外，還具有一個coiled-coil regions結構和一個N端的LCRs結構.LCRs是普遍存在于真核生物蛋白中的一種結構，與蛋白分子的分化有關，而且它在蛋白分子中的位置與其功能關系緊密.一般認為，位于蛋白端部的LCRs與蛋白的脅迫應答有關［20］，因此推測:OsHUB1可能在水稻的抗病性中發揮重要作用.coiled-coil regions結構往往與蛋白分子內高級結構的形成和蛋白分子間的相互作用有關［21］，這暗示水稻中可能存在OsHUB1的互作蛋白.根據 DHAWAN等人的研究，擬南芥HUB1基因的T-DNA插入突變體莖稈的表皮細胞壁與野生型相比明顯變薄，過量表達HUB1基因的植株表皮細胞壁則比野生型的明顯變厚，表明HUB1很可能通過改變細胞壁厚度來抵抗病原菌的侵染，這與植物通過細胞壁的物理屏障抵抗腐生病原真菌的抗病機制相符合.此外，研究發現，AtHUB1能夠與轉錄介體復合物的一個亞基MED21發生相互作用，該亞基不僅能夠增強植物抗病性，還對種子的胚胎發育具有重要的調節作用.同時還發現，AtHUB1和AtMED21都可以被幾丁質誘導表達［19］，這暗示AtHUB1是協同AtMED21，并通過激活植物病原相關分子模式激發的免疫反應(Pathogen Associated Molecular Pattern triggered immunity，PTI)來調控植物對腐生病原真菌的抗病性.在對果蠅的研究中發現，不同的基因轉錄激活過程都需要轉錄介體復合物的參與，其中包括抗微生物多肽的表達［22］，因此普遍認為，當上游調節因子和染色質發生修飾時，MED21能夠感受這些信號并將其傳遞給RNA聚合酶II來調控相關基因的表達.但是根據我們尚未發表的實驗結果，水稻OsHUB1與OsMED21之間并不存在明顯的相互作用(未發表數據)，這暗示水稻OsHUB1與擬南芥中同源基因的生物功能可能存在差異.因此，為了闡明水稻OsHUB1基因的生物學功能，需要通過構建該基因在水稻中的敲除(或敲減)突變體和過量表達突變體來做進一步的分析.

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