乙醇濃醪發酵技術研究進展

張強，韓德明，李明堂

（長春理工大學生命科學技術學院，吉林 長春 130022）

20世紀70年代全球性能源危機使生物質能源的開發和利用重新引起了人們的重視。目前，許多國家已經開始了生物質能源的開發，其中燃料乙醇的生產尤為引人注目。但燃料乙醇目前生產成本較高，缺乏市場競爭力，因此，最大限度降低生產成本對于燃料乙醇工業健康發展意義重大[1]。

乙醇生產過程中，發酵強度是考核發酵產業的一個重要指標。乙醇濃醪發酵技術是提高發酵強度的重要措施，即在發酵罐體積不變的情況下，通過提高乙醇濃度來提高乙醇的產量。濃醪發酵具有高細胞密度、高產物濃度和高生產速率等特點，是發酵工業的發展目標和方向。采用濃醪發酵可使發酵液中乙醇含量達到18%（體積比，下同）以上，而普通發酵只能產生9%～11%乙醇。因此濃醪發酵具有提高終點乙醇濃度、降低能耗、節約工藝用水、提高設備利用率等優勢，從而有效降低了乙醇生產成本，具有廣泛的應用價值[2]。

本文主要介紹了乙醇濃醪發酵定義、優勢以及影響乙醇濃醪發酵的因素，重點對實現乙醇濃醪發酵技術的途徑進行了綜述。

1 乙醇濃醪發酵的定義

由于微生物菌種、發酵原料以及發酵產品的差異，因此對濃醪發酵底物濃度界限存在著明顯的差別，目前對乙醇濃醪發酵還沒有統一的定義，各方觀點并不一致。濃醪發酵最初是由Casey等提出，他認為100 g發酵液中可溶性固形物大于或等于18 g即為濃醪發酵。傳統發酵中，一般100 g發酵液中可溶性固形物含量為11～12 g，而達到13～16 g就被定義為濃醪發酵[3]?，F在乙醇生產企業發酵醪液中含20%～24%的可溶固形物，被認為是正常濃度發酵，當糖化醪中含有30%或更高的可溶性固形物，則為濃醪發酵。當然，隨著發酵技術不斷進步，濃醪發酵標準有逐漸提高的趨勢。

2 乙醇濃醪發酵的優勢

乙醇濃醪發酵，單位時間內可獲得更多的乙醇產物，因而與普通乙醇發酵工藝相比，濃醪發酵具有更加明顯的優勢。

2.1 節約用水

水是重要的反應物，沒有足夠水參與反應，會使醪液糊化液化不徹底，導致原料利用率下降。一般乙醇生產企業發酵所采用的料水比通常為1∶2.5左右，而采用濃醪發酵料水比可減為 1∶（1.8～2.0），因此每生產1 t乙醇可節約工藝用水2 t 以上，同時也減少了廢水的排放。

2.2 降低酒糟（DDGS）的生產成本

酒糟是乙醇生產的副產物，是構成企業經濟效益的重要產品，企業每生產1 t乙醇可得到900 kg左右的酒糟飼料。發酵醪濃度高，固形物含量也高，酒糟分離、干燥費用也低，DDGS生產成本也會相應降低。表1為不同乙醇濃度下廢液量及酒糟干物質濃度對比，國內乙醇生產企業發酵成熟醪液的乙醇體積分數為9%～11%，因此每生產1 t 95%的乙醇，將產生約10.5 t糟液，酒糟中干物質質量分數為8%左右。從表1中可以看出，發酵液中乙醇濃度提高后，乙醇糟液量明顯減少，酒糟中干物質質量分數顯著提高，從而降低了DDGS生產成本[4]。

表1 不同乙醇濃度下廢液量及酒糟干物質質量分數對比

2.3 降低能耗

乙醇生產中，除原料消耗以外，能耗是乙醇廠主要的支出之一，具體表現在煤和電的消耗上。乙醇生產過程中蒸煮、發酵、蒸餾和酒糟濃縮干燥等工段常常消耗大量的能耗。采用濃醪發酵技術可明顯減少蒸汽用量.假如發酵液中乙醇濃度僅增加1%，僅蒸餾工段就可以節約蒸汽約150 kg。

2.4 提高設備利用率

由于濃醪發酵速度快，在基本相同或接近的發酵時間情況下，設備利用率可提高20%左右。

3 影響乙醇濃醪發酵的因素

乙醇發酵是一個復雜的生化反應過程，既包括動量、熱量以及質量的傳遞，又包括微生物代謝過程，尤其對于乙醇濃醪發酵，影響因素更為復雜。

3.1 葡萄糖代謝的影響

葡萄糖是酵母菌進行乙醇發酵的主要營養物質。高濃度葡萄糖對酶的生物合成以及糖酵解過程酶活力都有不利影響，即葡萄糖阻遏作用。發酵初期，通常細胞所受糖的抑制作用大于乙醇的作用，因此解決高濃度葡萄糖的抑制作用是實現乙醇濃醪發酵的關鍵[5]。

3.2 乙醇的抑制作用

乙醇會對酵母菌產生毒害作用。 隨著發酵液里乙醇濃度增加，乙醇對釀酒酵母的毒性隨之增大。高濃度乙醇對細胞的毒害作用主要表現在對細胞形態和細胞生理活動影響兩個方面。細胞形態變化主要表現為細胞骨架變得疏散。細胞生理活動變化主要體現在生物大分子物質的合成與代謝受阻以及糖酵解相關酶酶活性變化等。

對于一般酵母菌株來講，當醪液乙醇含量超過23%時，酵母菌細胞就會死亡；當乙醇含量低于3.8%時，其對酵母菌細胞生長代謝幾乎沒有影響。

3.3 發酵工藝條件的影響

溶氧和溫度是影響乙醇濃醪發酵的重要因素。

氧氣除可以促進細胞生長外，還可以促進不飽和脂肪酸和類脂質等存活因子的合成。存活因子對于菌體抵抗乙醇毒性具有重要作用，但存活因子僅在氧氣存在下才能合成。因此，溶氧的調控值得關注。

高溫有利于乙醇發酵，但高溫對濃醪發酵的影響遠大于一般的乙醇發酵。由于濃醪發酵溶液的高滲作用，容易導致細胞膜破裂，而溫度升高則會影響膜內脂的流動性，加速細胞膜的破裂。因此，溫度的調控也值得關注。除了上述溶氧和溫度兩因素外，還有其他一些因素如pH值等對酵母菌的生長和發酵也有影響。

3.4 營養物質的影響

乙醇濃醪發酵過程中，添加適宜的營養物質，例如氮源和營養鹽等，才能保證酵母菌生長健壯以及抵抗較高滲透壓的影響，增加乙醇產出。因此營養物是一個非常關鍵的因素，及時添加這類營養物質對乙醇濃醪發酵極為重要。

4 實現乙醇濃醪發酵的途徑

4.1 降低發酵醪液的黏度

乙醇濃醪發酵過程中，由于投料比例加大，勢必會造成發酵醪液黏度增加。目前我國乙醇生產企業發酵成熟醪乙醇體積分數約為11%，而美國有的乙醇企業發酵醪乙醇體積分數已達 18%，并正向23%努力。根據發酵醪乙醇濃度，可以利用淀粉水解以及葡萄糖乙醇發酵反應式來計算水與玉米粉的調漿比例。反應式見式（1）、式（2）。

按照上述反應方程式，即可計算出不同乙醇濃度情況下淀粉用量以及玉米粉用量，從而可以確定水與玉米粉調漿比例，具體結果見表2。

從表2可知，隨著乙醇濃度增加，水與玉米粉的調漿比例發生很大變化。當乙醇體積分數達到23%時，水與玉米粉的比例接近1∶1水平。因此要想達到預期的乙醇濃度，必須達到最基本的水與玉米粉混合理論比例。但這樣的比例如果用細玉米粉調漿，很容易出現醪液黏度大造成物料輸送不暢[4]。目前大多數乙醇生產企業采用的玉米粉碎粒度在1.6～1.8 mm之間，粒度過大會導致液化糖化不徹底，造成原料浪費；而粒度過小、粉碎過細會增加預處理的能耗。所以一些乙醇濃醪發酵企業，采用粗玉米粉，粉碎粒度直徑約 3 mm，以降低玉米料液黏度，由于采用大顆粒粉碎，這樣醪液中有“濃”有“稀”，效果比細粉好。

表2 不同乙醇體積分數下水與玉米粉的調漿比例

另外，隨著α-淀粉酶和噴射液化技術在乙醇生產中應用越來越廣泛，大大降低了成熟醪中殘余淀粉的含量。濃醪發酵采用液化酶二次添加方式，能達到很好降低醪液黏度的效果[4]。黃宇彤[6]認為，玉米粉加熱過程中黏度升高主要由于淀粉糊化和蛋白質變性引起的，因此在玉米粉糊化前，加入10 U/g的液化酶預處理20 min，可降低醪液黏度和峰值黏度持續時間，因此原料處理過程中糊化、液化的研究對于降低醪液黏度必將起到積極的作用。

4.2 篩選高耐性釀酒酵母

酵母是乙醇發酵的動力，發酵過程一般要求菌體：①繁殖速度快，發酵能力強；②具有較強耐乙醇能力，能進行濃醪發酵；③抗雜菌能力強；④對培養基適應性強。發酵過程中，隨著發酵液里的乙醇濃度增加，乙醇對酵母毒性增大。研究表明，通過篩選、誘變、原生質體融合、基因重組等技術可提高乙醇酵母的耐受性，實現濃醪發酵。

吳華昌等[7]從白酒窖池的酒糟中分離篩選出一株耐18%乙醇的菌株A2。20%葡萄糖發酵72 h后，發酵液乙醇體積分數達到9.5%。伍彥華等[8]通過篩選獲得一株自絮凝酵母FJY，以木薯為原料進行乙醇濃醪發酵，發酵86 h后，最終乙醇體積分數達到15.7%。

紫外誘變以及原生質體融合等技術是獲得高耐性菌株常規而有效的手段。徐琳[9]對實驗室自備的酵母菌進行紫外線誘變和雜交處理，選育出適合于濃醪發酵的高產酵母菌J-l-l-3，該菌株在料水比1∶2的發酵液中，發酵85～96 h乙醇含量達到14.1%。彭源德等[10]通過篩選以及紫外誘變育種，獲得1株編號為 S132的耐受性優良乙醇酵母，能夠耐受40 ℃高溫和 16%乙醇。 王濱等[11]利用篩選出的酵母菌，經紫外線誘變原生質體，選育出乙醇高產菌株Y316-23。當料水比為1∶1.8時，發酵60 h，發酵醪的乙醇體積分數達到13.5%以上。劉建軍等[12]利用熱沖擊、紫外線和γ-射線聯合作用獲得一株高產乙醇酵母NHY4-36 ，該酵母菌發酵可獲得17.5%的乙醇，能夠耐受20%以上的乙醇。

另外，湖北安琪集團采用活性干酵母在實驗室進行淀粉質原料乙醇發酵，在料水比1∶（1.8～2），發酵醪液中淀粉質量分數23%～25%情況下，最終的乙醇體積分數達到了16%左右[13]。

4.3 添加酶制劑

各種酶制劑在淀粉質原料乙醇發酵過程中發揮著重要作用，但由于原料中淀粉及蛋白質含量的差異，其添加量、添加時間和添加方式也存在明顯不同。

蛋白酶能夠水解蛋白質，破壞淀粉顆粒間結構，有利于糖化酶的作用。另外蛋白酶水解蛋白質生成大量自由氨基氮物質，能夠促進酵母生長與繁殖，也可促進未完全水解的淀粉和蛋白質的分離，從而降低發酵醪液的黏度。宋書玉等[14]在乙醇濃醪發酵過程中，添加適量的酸性蛋白酶，可縮短發酵周期至48 h，原料出酒率比對照提高約1.04%，噸乙醇可節省玉米用量102 kg。黃河[15]在玉米乙醇濃醪發酵過程中，酸性蛋白酶的添加量在20 U/g玉米時，乙醇濃度達到 14.8%，淀粉出酒率提高幅度最大。趙華等[16]在糖化結束后按4 U/g原料添加酸性蛋白酶，發酵70 h，醪液中乙醇體積分數可達13.2%。王晨霞等[17]在乙醇濃醪發酵工藝研究中發現，濃醪發酵中添加酸性蛋白酶，在起始總糖為28.25%的情況下，酒度達到15.94%，與對照相比，酒度提高了4.87%。

玉米原料除含有大量淀粉外 ，還含有一定 量與淀粉顆粒緊密結合的粗纖維和油脂等， 因此，添加適當酶制劑，可以破壞原料結構，充分發揮糖化酶作用，提高乙醇濃度。所麗娜等[18]探討了添加乙醇復合酶（木聚糖酶和脂肪酶）對玉米乙醇濃醪發酵的影響。添加0.75 g/100 g原料的乙醇復合酶，發酵乙醇體積分數達到16.35%，料水比可達1∶2.2，表明添加乙醇復合酶對乙醇濃醪發酵有明顯的促進作用。韓宏明[19]研究了木薯乙醇專用復合酶對木薯乙醇濃醪發酵的影響。表明添加木薯乙醇專用復合酶對木薯乙醇發酵有明顯促進作用，與對照組相比，在料水比為1∶2.2的條件下，添加0.30 g/100 g原料的木薯乙醇專用復合酶，酒度達到13.13%。

另外，在谷物原料乙醇發酵中，添加適量的植酸酶不僅可以促進淀粉和蛋白質的降解，還可以將植酸鹽轉化為肌醇和磷酸鹽，從而增加了酵母菌的營養，提高了菌體發酵強度。邱立友等[20]在玉米原料乙醇發酵醪中添加15 u/g 原料的植酸酶，原料出酒率可達39.81%，比對照組提高了6.96%。

4.4 改變發酵工藝模式

乙醇濃醪發酵，由于物料濃度高，物料的糊化、液化會變得非常困難。采用生料發酵，即原料不需蒸煮和預先糖化，直接進行發酵，可使發酵醪黏度降低，單糖的含量始終保持在較低的水平。

池振明等[21]利用高濃度乙醇酵母菌 HO，采用玉米面生料發酵，糖化酶加量為300 U/g 原料，當原料濃度為330 g/L時，酵母菌在70 h內可產生17.5%的乙醇；當原料濃度為360 g/L時，該菌株在96 h內可以產生 18%的乙醇。 許宏賢[22]以全磨玉米為原料，采用生料工藝發酵，底物濃度為350 g/L，使用市售乙醇干酵母，在98 h內發酵醪液乙醇濃度可達20%以上。馬文超等[23]利用篩選的糖化酶作為糖化劑，進行玉米無蒸煮乙醇發酵，糖化酶添加量為100 U/g原料，料水比1∶2，30 ℃恒溫發酵60～70 h，發酵醪乙醇體積分數達15%。

由于高濃度葡萄糖對酵母菌形成的高滲作用，抑制了酵母菌細胞的生長繁殖，所以葡萄糖應采用“定量供應”的辦法。同步糖化發酵（SSF）將糖化與發酵過程相結合，葡萄糖一經水解即被酵母吸收轉化為乙醇，可顯著降低葡萄糖濃度，緩解高濃度葡萄糖對酵母的影響。

Sathaporn 等[24]采用固形物含量為 304 g/L 土豆原料，首先加入果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶降低原料的黏度，然后經過液化和糖化作用，30 ℃下進行SSF，乙醇產量為16.61%。晏輝等[25]以餐廚垃圾為原料，應用同步糖化發酵制取乙醇，在適宜的乙醇發酵條件范圍內，乙醇體積分數達到10%。李志軍等[26]使用安琪耐高溫釀酒活性干酵母，以玉米為原料生產乙醇，采用SSF工藝，從三角瓶小試到5 t罐中試，最終乙醇體積分數達到13.6%。

另外，在乙醇發酵過程中，解除產物抑制也是提高乙醇發酵的關鍵。膜分離、抽提及閃蒸等工藝可有效地分離移除乙醇，降低或消除對酵母生長影響。Costa 等[27]在發酵過程中通過在發酵容器上方連接真空泵形成低壓狀態，可將揮發性高的乙醇從發酵液中抽提出來，從而獲得了23.0～26.7 g/(L·h)的乙醇產率。常春等[28]采用蒸汽爆破的玉米秸稈為原料，采用預酶解補料和耦合真空分離技術進行活性干酵母乙醇發酵，當原料質量分數為30%時，乙醇得率為44.98%，有效提高了乙醇產量。以上乙醇分離工藝雖然理論上具有一定的可行性，但要真正實施卻存在很多問題，例如需要增加附加設備以及相關材料投資，增加了乙醇的生產成本。

4.5 添加適宜的培養基成分

Casey等[29]認為，營養物質是酵母菌生長及代謝的重要物質，如果能夠滿足菌體的營養需要，可促進乙醇發酵速度和增加乙醇濃度。培養基是酵母菌營養和能量的來源，在發酵過程中起著非常重要的作用。高濃度的糖類導致滲透壓的增加，會對酵母造成危害。大量研究發現，在培養基中加入適量的營養物質，如海藻糖、脂肪酸以及肌醇等，都可以有效提高酵母菌耐乙醇能力，增加在高濃度乙醇條件下酵母的存活率。

劉代武等[30]采用安琪耐高溫乙醇活性干酵母，以玉米為原料進行濃醪發酵工藝條件的研究，發現適當添加無機鹽和營養鹽，發酵70 h，最終發酵酒度可達14.7%。

邢建宇等[31]研究發現飽和脂肪酸（例如棕櫚酸、硬脂酸）和不飽和脂肪酸（例如油酸）都可以通過增強細胞膜滲透屏障來提高菌體的耐乙醇能力，表明它們在釀酒酵母乙醇耐受性方面具有一定的作用。胡純鏗等[32]在培養基中分別添加棕櫚酸、亞油酸和亞麻酸，發現富含棕櫚酸的酵母細胞存活率最高，菌體具有較強耐乙醇能力。

其他物質，如酵母膏、蛋白胨等也能夠有效提高酵母菌的乙醇耐受性。邢建宇等[33]研究了培養基組分對釀酒酵母生長以及乙醇耐受能力的影響。發現酵母膏對釀酒酵母影響最大，分別提高酵母膏和蛋白胨含量，都可以在發酵各個階段提高酵母細胞乙醇耐受性及發酵能力。

肌醇是磷脂的重要組分之一，而磷脂是細胞膜的最重要成分。季冉等[34]研究發現，高濃度肌醇能夠對質膜ATP酶和質膜完整性起保護作用，以免受高濃度乙醇毒害，因此隨肌醇濃度增加，酵母乙醇耐受能力隨之增加。

另據報道，在酵母菌的培養基中添加粗卵磷脂、清蛋白、Tween80 或麥角固醇，也可以提高酵母菌的生長速度，縮短發酵時間[35]。

高底物濃度還會導致低水活性，從而造成對酵母細胞的毒害作用。為了維持細胞存活性，必須減小培養基的滲透壓。薛穎敏等[36]利用滲透壓保護劑和營養物質對釀酒酵母X330 耐乙醇性能進行了研究，發現甘氨酸和脯氨酸作為滲透壓保護劑能有效提高菌體乙醇耐受性能，甘氨酸的促進作用強于脯氨酸。

5 結 論

乙醇濃醪發酵是一項極具前景的技術，不必對工廠現有設備進行大規模改造，卻能降低生產成本，顯著提高乙醇廠綜合效益。它具有高細胞密度、高產物濃度和高生產速率等特點以及顯而易見的優勢，將大大改善目前我國乙醇工業的技術水平，是乙醇發酵工業的發展目標和方向。

但由于乙醇濃醪發酵中仍然存在一些問題，如高濃度糖化液的制備、濃醪物料的輸送、高濃度葡萄糖以及高濃度乙醇對酵母的抑制作用等問題，需要不斷進行研究。但濃醪發酵最重要、最根本的仍是酵母問題，如何選育具備更高的耐滲透壓能力、更高的耐乙醇能力以及更強的發酵能力的釀酒酵母，是實現乙醇濃醪發酵的關鍵?？梢酝ㄟ^兩條途徑獲得高耐受性酵母菌株。一是通過直接篩選、誘變育種、細胞雜交等傳統菌種選育方法，通過這些方法選育出來的菌種實用性強、生產穩定性好。二是通過基因工程以及原生質體融合等現代育種手段對酵母進行基因改造，從而獲得高耐受性酵母菌株。同時也應該對酵母的乙醇耐受機理以及抗脅迫機制進行深入研究，從而有力推動乙醇濃醪技術的發展。

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