中藥植物雌激素雙向調節的機制研究

陳 嬙，李文蘭，丁振鐸，張進進，高 尚，李靜怡

(1.哈爾濱商業大學生命科學與環境科學研究中心，哈爾濱150076;2.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱150076;3.黑龍江生態工程職業學院，哈爾濱150025)

中藥“雙向調節”研究日趨得到重視，某些具有雙向調節作用的中藥，可在非毒性劑量下將趨于亢進/低下的生理狀況向平衡狀態調節，即“扶正”作用，可用以調節性質相反的兩種病理狀態，使機體恢復至正常生理水平.已有多種常用中藥被證實具有雙向調節作用，如黃芪對血壓升降的調節作用［1］，三七止血又能活血的作用等［2］.天然存在的植物雌激素是非固醇類，與內源性雌激素17β－雌二醇結構相似，均為雙酚環結構，由于這種相似的構象，使植物雌激素也能夠與機體內雌激素受體結合，表現出弱雌激素樣作用.在體內，植物雌激素具雙向調節作用，一方面，當機體內雌激素水平低于正常水平時，可發揮擬雌激素樣作用，這一作用可以防治女性更年期綜合征、前列腺癌、骨質疏松癥和心血管疾病等.另一方面，在體內雌激素水平高于正常水平(如乳腺增生、子宮肌瘤等病癥)時，可產生雌激素拮抗作用，有效減弱靶細胞對雌激素的應答.因此也有人稱其為“選擇性雌激素受體調節劑”.目前已知的植物雌激素可分為5類:異黃酮(isoflavones)類，典型的如大豆中的大豆異黃酮(Soy Isoflavones P.E)，金雀花中的染料木黃酮(genistein);木脂素類(lignans)，如杜仲中松脂素二葡萄糖苷(Pinoresinol Diglucoside);二苯乙烯類(stibenes)，如白藜蘆醇二聚體;香豆素類(coumestans)，如補骨脂中的補骨脂素、異補骨脂素;真菌類(mycoestrogen)，如玉米赤霉烯酮(ZEA)［3］.其作用機制不完全相同，與該類化合物本身的結構有密切的關系.本文將對中藥植物雌激素的雙向調節的作用機制研究加以概述，以期總結出中藥植物雌激素作用的異同點，為后續化合物的雌激素作用研究方向提供參考，為臨床上中藥植物雌激素的應用以及其作為保健品的開發提供可靠的借鑒及依據.

1 植物雌激素雙向調節作用途徑

1.1 植物雌激素與雌激素受體ER結合途徑

1.1.1 雌激素受體及其分布

雌激素受體(ER)［4］是一類由特定配體激活的轉錄因子，是核受體超家族的成員.哺乳動物中存在兩種雌激素受體亞型ERα和ERβ，在細胞核、細胞膜、細胞質中均有存在.但目前研究較深入的主要還是植物雌激素與核受體結合途徑.ERα和ERβ這兩種亞型可介導雌激素相關的作用.ERα和ERβ在機體內分布廣泛:ERαmRNA主要在子宮、附睪、睪丸、腎、腦下垂體和腎上腺中高表達;ERβ主要在子宮、卵巢、睪丸、前列腺、膀胱、肺和腦中高表達.具體的如正常乳腺細胞中，ERβ表達水平低于ERα，而乳腺癌細胞中ERα高表達，ERβ低表達，推測ERβ在乳腺組織癌變時可能起到保護作用［5］.前列腺組織中，ERβ占主導地位，幾乎沒有ERα表達.在輸卵管、陰道上皮部位ERβ弱表達，主要表達ERα;而卵巢中則主要表達ERβ.除月經周期第24～26d，女性體內ERα的表達均高于ERβ［6］.植物雌激素樣化合物在不同組織中、不同生理狀態時，通過與雌激素受體ERα和/或ERβ結合，產生一定的擬/或抗雌激素樣作用，因此雌激素受體亞型組織如何分布直接影響其結合情況，進而影響其在功能上的差異.

1.1.2 植物雌激素與雌激素受體ER直接相關的調節作用

ERα和ERβ這兩種亞型有兩個獨立的基因編碼［7］(如圖1).從基因角度總的來看，在雌激素受體的轉錄調控區(A/B)和配體/激素結合域(LBD)，AF－1和AF－2是兩個轉錄激活區.AF－1是一個當雌二醇缺乏或只有植物雌激素樣化合物存在時也可激活基因轉錄的活性功能區，具有組成性激活活性.AF－2為配體依賴區，是受雌激素約束的基因激活與應答功能區，具有調節轉錄激活作用，能與許多共激活因子相互作用.但對于ERα和ERβ，AF－1和AF－2的轉錄活性又有所不同.ERβ中AF－1區并無轉錄活性，但若去除AF－1，將明顯提高ERβ轉錄活性，提示ERβ對雌激素的轉錄活性是由AF－2介導，且AF－l可抑制ERβ中AF－2的表達.而單獨的ERα與ERβ的AF－2區域的活力相似，其與內源性雌激素17β－雌二醇的親和力也十分相近.故當轉錄基因同時需要AF－1和AF－2時，由于ERβ的AF－1對AF－2的抑制作用，ERα的功能較ERβ強，在不需要AF－1參與時，兩種ER的功能相當.兩種雌激素受體與配體雖有相似的結合特性，但二者對蛋白結合位點AP－1起反信號作用:雌二醇與ERα結合后激活轉錄，與ERβ結合后抑制轉錄.因此ERβ對雌二醇的親和力不如ERα［8］，故在無植物雌激素或僅在雌二醇作用下，多數細胞內ERαmRNA的基礎轉錄活性高于 ERβmRNA，隨17β－雌二醇劑量增長，ERα性呈依賴性升高.而ERβ在低濃度17β－雌二醇時，ERα的活性隨ERβ表達增加而減少，而在飽和濃度下ERβ表達的增加，對ERα的轉錄活性無任何影響，且基因表達的總體強度增加.這表明ERβ可作為ERα活性的調節劑［9］.

圖1 ER的結構

雌激素與ERα和ERβ具有相似的親和力，但多數具有植物雌激素活性物質，尤其是異黃酮類，對ERβ的親和力遠高于ERα.研究表明，異黃酮類物質能使ERβ的AF－2表面更易于結合共調節因子，從而對靶基因具有ERβ依賴性的轉錄調節作用［10］.如菟絲子中槲皮素、山柰酚與異鼠李素較傾向作用于 ERβ［11］.染料木黃酮(Genistein)與 ER 結合后，ERβ的對共激活因子SRC－1a的親和力比與ERα高出12 000倍，對TIF2的親和力比ERα高出33 倍［12］;Staar等［13］研究表明，染料木黃酮和大豆苷元對子宮內膜腺細胞ERα和ERβmRNA和蛋白質水平表現為不同的調節作用:使ERβmRNA和蛋白質水平上調，而使ERαmRNA和蛋白質水平下調.大豆異黃酮代謝產物雌馬酚具有更高的生物活性，它有兩個對應異構體，R－雌馬酚和S－雌馬酚，二者與ERα和ERβ的親和力有所不同.S型與ERβ的親和力較強;R型與ERα的親和力較弱，與ERβ的親和力更弱.兩種異構體與ER的親和力均高于大豆苷.染料木黃酮與ER的親和力接近17－β雌二醇，但誘發轉錄的能力很低，大豆苷與ER的親和力遠低于染料木黃酮，轉錄活性也很差，相比之下雌馬酚與ER的親和力接近染料木黃酮，且誘發轉錄的能力在異黃酮衍生物中是最高的［14］.因此在ERα表達豐富的組織，具有植物雌激素樣作用的化合物通常表現為雌激素拮抗的作用(因其與ERα的親和力低)，而在ERβ表達豐富的組織，足夠劑量時植物雌激素才表現為雌激素樣作用.

ER被雌激素樣化合物激活后，可通過雌激素應答的經典途徑實現各種生理效應.活化后的ER與雌激素應答元件ERE結合，ER與阻遏物的結合解離，繼而受體二聚化形成二聚體復合物，改變其配體或激素結合域構象，暴露出雌激素受體激活基因轉錄的主要功能區AF－2，輔調節蛋白可在其表面結合，進一步激活基因轉錄，通過mRNA對蛋白質的翻譯，實現各種生理效應.近年來，在含有雌激素受體的細胞中如乳腺癌(MCF－7)、神經母細胞瘤(Neuro－2a)以及成骨肉瘤細胞(MG－63)的研究中發現大豆苷元和染料木黃酮通過ERα和ERβ對ERE下游報道基因的轉錄調節作用.研究顯示，葛根中的植物雌激素成分葛根素(Puerarin)及其衍生物脫氧微雌醇，可以選擇性結合小鼠肝細胞(CV－1)細胞中ERα及ERβ，激活ERE報告基因的轉錄，發揮雌激素樣作用［15］.玉米赤霉烯酮(ZEA)及其代謝產物通過與雌激素受體ER結合發揮雌激素作用.受體－ZEA結合物被轉移到細胞核，激活雌激素反應受體，從而轉錄活化基因.多項研究均證明，ZEA及其代謝產物對雌激素受體有競爭激活或拮抗兩種類型的作用，細胞實驗表明，無論是轉染雌激素受體ERα還是ERβ，ZEA都是ERα受體的完全激活劑，而僅是 ERβ的部分激活劑［16］，則小劑量的ZEA起到抗雌激素作用，足夠劑量時起到擬雌激素的作用.

除了與雌激素反應元件(ERE)結合的作用機制，植物雌激素還可以與激活蛋白l(activated protein l，AP－1)相結合.AP－1是包含兩個蛋白(c－Jun和c－Fos)的轉錄因子.其中，c－Jun可直接結合到靶基因啟動子的特異序列上.研究認為:雌激素主要通過ERE途徑調節基因轉錄，而植物雌激素類化合物主要通過AP－1途徑激活靶基因，即配體結合ER后，ER再與轉錄因子AP－1結合，AP－1再結合在靶基因啟動子特異序列上，從而調節靶基因轉錄;同時，AP－l路徑也需要AF－1的存在，而且聚集輔調節蛋白至AF－1結構域上，破壞AF－2表面，使與ERE結合的雌二醇的激活作用喪失，而AF－2突變后，植物雌激素激活AP－1的路徑仍被保留;但也有報道發現:AF－2缺失不僅可使雌二醇，也可使植物雌激素白藜蘆醇(Resveratrol)的激活作用喪失，說明有些植物雌激素的作用途徑與雌二醇相似.采用報告基因技術分析法，在菟絲子中，發現其成分金絲桃苷和山柰酚可通過人ERα或ERβ介導，誘導AP－1熒光素酶報告基因表達，說明其具有抗雌激素樣活性［11］.在AP－1路徑上，植物雌激素作用強于雌二醇.研究發現，雌二醇與ERα結合后可活化AP－1，而與ERβ結合可減少AP－1的轉錄，其效應較為復雜，分子機制尚不完全清楚.也有研究表明，有些化合物對ERα的激活作用強于ERβ.如丹參酮I可誘導T47D細胞ERα和ERβ蛋白表達水平均有所升高［17］，并且對ERα的升高效應更為明顯.在基因水平上，丹參酮I能提高ERα和ERβmRNA的表達量;且相對而言，丹參酮I對ERαmRNA表達量的升高作用更為明顯.

1.2 植物雌激素與內源性雌激素合成相關酶間的作用

植物雌激素還可抑制與雌激素合成相關酶的活性，從而減少內源性雌激素17β－雌二醇的合成來達到抗雌激素的作用.多種生物酶如17α－羥化酶(CYP17)、芳香化酶(CYP19)、17β－羥基甾體脫氫酶(17β－HSD)、甾體硫酸酯酶(STS)等是體內雌激素的合成所必須的.內源性合成的雌激素與直接關系到乳腺癌的發病率，因此，抑制內源性雌激素合成過程中相關酶的活性可以減少雌激素合成的途徑，這對控制乳腺癌的發生具有重要意義..植物雌激素可通過抑制17β－HSD、CYP19等酶的合成，對腫瘤生長所需要的雌激素環境造成影響.黃酮與二氫黃酮類的植物雌激素，對CYP19的效果最佳，異黃酮類化合物也可以在一定程度上抑制CYP19的功能.中藥益母草所含成分益母草堿、水蘇堿［18］與雌激素結構完全不同，但其對心血管系統和生殖系統的作用類似于植物雌激素.推測益母草可能是通過影響內源性雌激素合成及代謝過程來實現其雌激素樣作用.

另外，植物雌激素還可能抑制了促性腺激素的排出，延長月經周期的卵泡期，從而對乳腺癌起到預防作用.月經周期延長，使女性一生暴露于黃體期的雌二醇水平降低，絕經前后乳腺癌發病風險因而降低.

2 植物雌激素劑量影響

植物雌激素起著弱雌激素作用，低劑量時，其擬雌激素效應不明顯，但某些中藥成分可與ERβ結合，發揮雌激素拮抗作用.中劑量時，某些中藥植物雌激素，可以產生一定的擬雌激素活性.高劑量時，植物雌激素活性成分通過活化因雌激素水平限制未能活化的ERβ，產生雌激素強效應.當使用足夠劑量的中藥植物雌激素時，可以產生與內源性17β－雌二醇相似的效能［19］.當染料木黃酮的濃度比17β－雌二醇高出104的濃度時，二者與ERβ的結合力持平;但在這種情況下，但在這種情況下，染料木黃酮所與17β－雌二醇所誘發的ERβ構象的改變仍然不同，染料木黃酮與后面的共激活因子結合的能力低于雌二醇［20］.葛根素對雌性大鼠生殖器官具有弱雌激素樣作用，可能是由于葛根素對ERα和ERβ的親和力較弱，葛根素僅在1×10–6mol/L時對乳腺癌細胞MCF－7具有增殖作用，其雌激素作用比 17β－雌二醇低 102～105倍［21］.Wang等［22］發現柴胡皂苷d(SSd)可促進乳腺癌細胞MCF－7增殖，雌激素受體拮抗劑ICI182，780可抑制該作用，提示SSd的雌激素樣可能活性是通過ER介導的，并與劑量相關:當SSd劑量在0.01～10μmol/L時可通過ERα介導發揮作用，而僅當濃度為10μmol/L時通過ERβ途徑介導，推測SSd可能主要作用于ERα高表達的組織如生殖系統，非骨骼及腦部組織.［23］

3 結語

近年有研究發現雌激素的作用可在數秒或幾分鐘內發生，如雌激素調節血管張力的快速效應，這種瞬時效應說明雌激素未經直接活化基因，而是通過激活與膜結合的信號通路直接發揮作用.ER在細胞膜上也有分布，占雌激素受體的2% ～3%，但對中藥植物雌激素與膜受體結合的研究鮮有報道.由于植物雌激素的低毒性，也許可成為產生快速起效的新藥源.在研究中藥植物雌激素與人類健康的關系時，建議廣泛在體外動物模型、分子水平和人體實驗方面展開細致深入的研究，在使用劑量上進行嚴格篩選，是否對正反兩方面調節會產生影響，慎重考慮長期攝入中藥植物雌激素可能帶來的風險.

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