抑肽酶對實驗性慢性肝損傷超微結構改變的影響

王 強，王心童，王虹蛟*，孟威宏，顏煒群，任立群

0 引言

關于肝纖維化機制及防治研究，目前是國內外生物學、醫學研究的熱點之一［1-6］。目前，尚未見到有關抑肽酶對實驗性慢性肝損傷肝組織超微結構改變的研究報道。本研究利用四氯化碳(CCl4)建立Wister大鼠慢性肝損傷模型，同時給予抑肽酶，觀察其對慢性肝損傷肝組織超微結構改變的保護作用，并對其作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wister大鼠，雌雄兼用，由長春高新醫學動物研究中心提供，合格證號:醫動字第1055118。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠慢性CCl4肝損傷模型的建立 Wister大鼠，體重190～210 g，雌雄各半，由高新實驗動物中心供應。本實驗采用新鮮的花生油作為溶劑。將25%CCl4溶解于花生油中混勻。正常對照組僅皮下注射花生油5 mL/kg，其他各組大鼠首次給予CCl4原液5 mL/kg，以后每周2次25%CCl4液(花生油稀釋)5 mL/kg皮下注射。禁食，不禁水。

1.2.2 動物分組及給藥 (1)第1組為正常對照組:腹腔注射等量生理鹽水。(2)第2組為慢性肝損傷模型組:腹腔注射等量生理鹽水。(3)第3組為抑肽酶小劑量組:腹腔注射抑肽酶2萬KIU/kg。(4)第4組為抑肽酶中劑量組:腹腔注射抑肽酶4萬KIU/kg。(5)第5組為抑肽酶大劑量組:腹腔注射抑肽酶8萬KIU/kg。(6)第6組為促肝細胞生長素注射液組(陽性組):腹腔注射促肝細胞生長素100 mg/kg。3～5組每天給予抑肽酶一次，連用4周，第6組每天給予促肝細胞生長素1次，連用4周。禁食，不禁水。

1.2.3 肝組織切片制作 固定在4%戊二醛中的肝臟，經過戊二醛-鋨酸雙重固定，梯度乙醇、丙酮系列脫水，環氧樹脂包埋，半薄切片定位，超薄切片，醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察其超微結構改變。

2 結果

空白對照組肝細胞體積較大，肝細胞面可見細胞連接結構，膽小管兩端緊密連接的結構清晰;腔面可見較多微絨毛，肝血竇面微絨毛較多。肝細胞核呈圓形，核仁明顯，核內常染色質多。胞質內線粒體、粗面內質網及滑面內質網豐富，可見糖原顆粒和少量溶酶體(圖1)。

圖1 空白對照組(TEM bar=500 nm)

四氯化碳模型組肝細胞呈腫脹狀，細胞界限不清，膽小管兩端緊密連接消失;腔面微絨毛減少。肝細胞核呈圓形固縮狀;核內異染色質凝聚、趨邊;核基質空化。胞質內基質局部空化，細胞器呈絮狀或消失，部分線粒體外膜結構模糊，粗面內質網數量減少且呈散在分布(圖2)。

圖2 四氯化碳模型組(TEM bar=1μm)

抑肽酶小劑量組肝細胞體積大小不一，個別細胞呈固縮狀。膽小管輕度擴張;小管兩端連接結構清晰;腔面微絨毛減少，并可見髓樣小體。肝細胞核呈圓形，少量異染色質呈塊狀。胞質內線粒體呈堆分布;粗面內質網較少;部分細胞胞質內可見較多絮狀結構、少量脂滴及線粒體腫脹、嵴斷裂(圖3)。

圖3 促肝細胞生長素組(TEM bar=1 μm)

抑肽酶中劑量組肝細胞體積稍大;膽小管兩端緊密連接結構清楚;腔面微絨毛較多。核呈圓形，核仁明顯，可見少量塊狀的異染色質。胞質內線粒體數量多;粗面內質網較多且平行排列，呈堆分布;可見大量糖原聚集，偶見脂褐素顆粒(圖4)。

抑肽酶大劑量組肝細胞結構接近空白對照組，細胞體積較大，細胞界限清楚;膽小管結構正常。肝細胞核較大，呈圓形，核膜清晰;核內常染色質多，可見少量小塊狀的異染色質;核仁多個。胞質內可見大量線粒體;粗面內質網豐富，呈平行排列;可見少量糖原顆粒(圖5)。

圖4 抑肽酶小劑量組(TEM bar=1 μm)

圖5 抑肽酶中劑量組(TEM bar=1 μm)

促肝細胞生長素組肝細胞體積大小不等，細胞界限可辨;膽小管腔面微絨毛較多。細胞核呈圓形，核仁1個，呈圓形。胞質內線粒體、粗面內質網較多，可見少量糖原顆粒，偶見呈絮狀的細胞器結構(圖6)。

3 討論

圖6 抑肽酶大劑量組

肝纖維化是肝硬化病變發展過程中的一個重要環節，肝纖維化的發生機制是復雜的病理過程，肝細胞外基質的合成與降解處于動態失衡，即細胞外基質的合成增多或者降解減少可致細胞外基質沉積，最終誘發肝纖維化的形成。早期的纖維化是可逆的，但到后期有再生結節形成時則不可逆。肝纖維化的高危因素有腎素、血管緊張素系統(Reninangiotensin system，RAS)、基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPS)、血小板源性生長因子(Plateletderived growth factor，PDGF)和轉化生長 因 子 β (Transforming growth factor-beta，TGFβ)。除此之外，肝硬化的一些病因也是肝纖維化的致病因素，如病毒性肝炎、酒精中毒、高半胱氨酸血癥、毒物和一些藥物等。肝臟疾病已經被確定為世界健康問題中重要之一，很多因素可以導致肝臟病毒感染，包括藥物和毒物，肝缺血再灌注。CCl4是一種傳統的肝毒素，在動物實驗中被廣泛用于誘導肝臟損傷，通過阻斷或延緩炎癥反應過程和凋亡從而阻止或治療。氧化應激反應在CCl4誘導肝毒性損傷發揮重要的作用。大量研究表明，CCl4主要用于肝損傷，因為其主要代謝高活性三氯甲基自由基。CCl4誘導肝毒性損傷的另一個重要的病理機制是炎癥反應。已有報道在CCl4誘導急性肝毒性損傷中觀察到嚴重的肝細胞凋亡反應［7-14］。抑肽酶是一種有效的抗纖維蛋白溶解酶，其可以抑制多種絲氨酸蛋白酶，特別是血纖維蛋白溶酶、胰蛋白酶、凝乳蛋白酶、凝血酶和激肽釋放酶，除此之外，其還可以單獨抑制纖維蛋白溶解，具有抗炎作用，能降低白細胞激活作用和抑制細胞因子釋放。動物實驗結果表明，這種抑制炎性反應甚至可以提高神經反應，但此結果在人體研究中未得到證實。而且人類研究結果表明，其可能會降低中風發生率。廣譜抑肽酶在多個絲氨酸蛋白酶凝固和溶解纖維蛋白方面被認為是賴氨酸類似物。抑肽酶于1993年在美國被FDA首次批準使用，用在冠狀動脈旁路移植中減少失血作用。德國批注其為抑肽酶，在心臟和非心臟手術中有著非常重要的減少出血的作用［15-18］。本實驗結果顯示，抑肽酶對大鼠慢性CCl4肝損傷模型具有很好的保護性作用，能明顯減輕慢性肝損傷的程度，抑制肝纖維化的發展。其作用機制還不清楚，但從本實驗的結果可以認為，是從減輕肝細胞的損傷及抑制肝纖維化的發展兩個方面對慢性肝損傷起到保護性作用。

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