豬乙型腦炎病毒SA14－14－2疫苗株基礎種子的鑒定

巢 偉，張桂紅，徐 雷

(湖南中岸生物藥業有限公司，長沙410100)

乙型腦炎(Japanese Encephalitis，JE)又稱流行性乙型腦炎、日本乙型腦炎，簡稱乙腦，是由乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)引起的致人和動物中樞神經系統癥狀的人畜共患急性傳染病。豬是主要宿主及傳染源，人成為間接宿主，乙腦病毒形成豬—蚊—人的傳播循環。因此，乙型腦炎的防治研究不但對于豬的規?；B殖有重要的意義，而且有重要的公共衛生學意義。1988年，我國開始生產原代地鼠腎細胞乙腦減毒活疫苗(SA14－14－2株)，與乙腦滅活疫苗相比，抗體陽轉率較高，接種針次少，副反應明顯降低。目前，該疫苗是我國廣泛使用的乙腦疫苗，累積接種人數超過1.5億［1］。獸用乙腦活疫苗的應用，在國內從七十年代起，將人醫選育乙型腦炎減毒株5－3株用于豬，2－8株用于馬。由于兩毒株各自的缺陷及其它原因，在九十年代以后停用。受SA14－14－2減毒株十多年來在我國大面積推廣用于人群的成功經驗，擬將SA14－14－2株作為豬用乙腦弱毒株，進行了一系列試驗研究。

1 材料與方法

1.1 試劑和細胞 三價熒光抗體(牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒(BVDV/MD)、豬細小病毒(PPV)、豬瘟病毒(HCV))、綠猴腎(Vero)傳代細胞、PK15傳代細胞，由中國獸醫藥品監察所提供。流行性乙型腦炎特異性抗血清、乙腦強毒P3株(腹腔接種10～12 g小鼠半數致死量≥107.5LD50)，由中國藥品生物制品檢定所提供。乙腦診斷試劑盒由北京生物制品研究所提供。原代地鼠腎細胞、牛睪丸細胞、0.2%紅細胞懸液(豚鼠紅細胞、人“O”型紅細胞、雞紅細胞等量混合)，本公司實驗室自制。

1.2 實驗動物 乙腦抗體陰性的后備母豬(體重60～70 kg)、妊娠30日健康易感初懷母豬及4～8日齡健康易感乳豬，本公司健康動物房提供。SPF級小鼠由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。

1.3 基礎種子批 豬乙型腦炎病毒SA14－14－2疫苗株F5代、F6代、F7代凍干毒種，病毒含量分別為 107.8TCID50/mL、107.6TCID50/mL、107.7TCID50/mL，本公司種毒室制備。

1.4 外源病毒檢測

1.4.1 檢驗用原代細胞制備 用10～14日齡的SPF地鼠和1～4日齡健康小公牛，按常規方法制備地鼠腎原代細胞、牛睪丸細胞。分裝于25 mL的方瓶，置37℃培養，長滿單層后備用。

1.4.2 豬乙型腦炎凍干毒種與乙型腦炎特異性抗血清中和 將三批豬乙型腦炎基礎種子凍干毒，每批取2瓶，分別用PBS液作1000倍稀釋，加入乙型腦炎特異性抗血清等量混合。置37℃水浴中和90 min。

1.4.3 參照《中華人民共和國獸用生物制品規程》二○○○年版［2］“外源病毒檢驗法”進行熒光抗體法檢查外源病毒、綠猴腎傳代細胞檢查外源病毒和紅細胞吸附外源病毒試驗。

1.4.4 用地鼠腎細胞檢測偽狂犬病病毒 將中和后的豬乙型腦炎凍干毒種與血清的混合物接種地鼠腎原代細胞4瓶，培養4 d傳2代，每代7 d，觀察細胞病變。同時用偽狂犬病病毒Bartha－K61株接種地鼠腎原代細胞，每瓶加入含1000TCID50病毒的維持液3 mL，共接種4瓶作為陽性對照組。

1.4.5 用小鼠檢測狂犬病病毒 取1.4.4項地鼠腎細胞傳2代培養物(偽狂犬病病毒檢驗陰性)，每批腦內注射5～7日齡乳鼠5只，每只0.03 mL。觀察7～10 d，乳鼠不發病，并于第7 d剖殺其中2只，取鼠腦組織制成10%懸液腦內接種5～7日齡乳鼠5只，如此盲傳3代，最后一代觀察14 d，每代乳鼠健活為合格。

1.5 免疫原性檢測

1.5.1 小鼠免疫原性試驗 將三批豬乙型腦炎基礎種子凍干毒，用PBS液作10倍系列稀釋，選取10－3～10－5三個稀釋度，分別皮下注射 10 ～12 g小鼠5只，0.1 mL/只，14 d后分別以乙腦強毒P3株腹腔攻擊，每只0.3 mL(含≥500個LD50)，同時每只小鼠腦內接種稀釋液0.03 mL，觀察14日判定結果。對照小鼠死亡率應≥80%，按Reed－Muench法計算半數保護劑量。

1.5.2 后備母豬的免疫原性試驗 將豬乙型腦炎基礎種子F7代凍干毒稀釋至104～107TCID50免疫劑量，分別肌肉注射4頭健康敏感后備母豬。免疫4周后采血分離血清，分別采用反向血凝抑制試驗和蝕斑減少中和試驗測定抗體效價。后備母豬免疫4周后配種，配種40 d后，各肌肉注射乙腦強毒P3株105.8LD50(小鼠腹腔攻擊測定 LD50)。攻毒后72 h采血，接種原代地鼠腎細胞培養檢查病毒血癥。攻毒14 d后，每組剖殺兩頭，觀察胎兒成活情況，并取胎兒腦及脾制成10%懸液接種原代地鼠腎細胞分離病毒［3］。

1.6 毒力穩定性檢測 將豬乙型腦炎原始種子(F4代)凍干毒在原代地鼠腎單層細胞培養傳代，連續傳代至 F12代。分別選取F5代、F8代、F10代、F12代病毒培養液進行小鼠腦內致病力試驗，小鼠皮下感染入腦試驗，乳鼠傳代返祖試驗，測定該毒株在原代地鼠腎細胞培養傳代過程的毒力變化［4］。并選取上述相同代次病毒培養液經仔豬皮下回傳1代、分離病毒測定其豬體傳代毒力變化。同時選取F5代、F8代、F10代、F12代病毒液進行小鼠免疫原性試驗，測定該毒株在原代地鼠腎細胞培養傳代過程的免疫原性變化［5］。

1.7 安全性檢測

1.7.1 參照《中華人民共和國獸藥典》二○一○年版三部［6］“豬乙型腦炎活疫苗”進行小鼠腦內致病力試驗、皮下感染入腦試驗、毒性試驗和乳豬安全性檢驗。

1.7.2 大劑量接種初懷母豬的安全性試驗 將三批豬乙型腦炎基礎種子凍干毒種，每批接種懷孕30日健康易感初孕母豬4頭，每頭肌肉注射2 mL(含10頭份)，觀察一個月。每日觀察體溫、精神、飲食情況，特別注意懷孕狀況。統計分娩情況，并對死亡仔豬取腦組織懸液，分別接種原代地鼠腎細胞，36～37℃培養7 d，觀察病變。

2 結果

2.1 外源病毒檢測結果

2.1.1 用牛睪丸細胞檢查外源病毒BVDV/MD，PK15細胞檢查外源病毒HCV和PPV，三價熒光抗體染色后，被檢細胞片無特異性熒光，表明三批基礎種子無BVDV/MD、HCV和PPV污染。將三批基礎種子分別與乙型腦炎特異性抗血清中和后，每批接種3瓶Vero細胞，連傳2代，每代7 d，用顯微鏡觀察細胞，均未出現細胞病變。同時作紅細胞吸附試驗，經4℃和20～25℃兩種溫度吸附，鏡檢結果為陰性，表明三批基礎種子無能吸附紅細胞的外源病毒污染。

2.1.2 用地鼠腎細胞檢測偽狂犬病病毒，中和組細胞未出現病變，對照組細胞在接種后48 h出現明顯的細胞病變，表明三批基礎種子無偽狂犬病病毒污染。

2.1.3 用小鼠檢測狂犬病病毒，乳鼠取腦盲傳三代后，小鼠未出現肌肉震顫、步樣失調和麻痹死亡等狂犬病癥狀，剩余小鼠全部健活，表明三批基礎種子無狂犬病病毒污染。

2.2 免疫原性檢測結果

2.2.1 小鼠免疫原性試驗 三批基礎種子用小鼠測定半數保護劑量分別為103.23、103.27、103.20TCID50，表明三批基礎種子對小鼠免疫原性穩定。

2.2.2 后備母豬的免疫原性試驗 豬乙型腦炎基礎種子F7代凍干毒以105.0TCID50的免疫劑量即可使后備母豬全部抗體陽轉(表1)。

表1 不同劑量疫苗免疫豬抗體檢測試驗

以105.0TCID50病毒劑量免疫后備母豬，4周后中和抗體達到1∶37，可使母豬獲得堅強的免疫力，攻毒后72 h病毒血癥檢驗陰性，并保護胎兒不受病毒感染(表2)。

表2 后備母豬的免疫原性試驗

2.3 毒力穩定性檢測結果

2.3.1 選取F5代、F8代、F10代、F12代病毒培養液分別進行小鼠腦內致病力試驗、皮下感染入腦試驗和乳鼠傳代返祖試驗，小白鼠全部健活。表明各代次病毒培養液小鼠腦內致病力為零，皮下感染入腦致病力為零，毒力保持穩定不變，無返祖現象［7］。

2.3.2 選取F5代、F8代、F10代、F12代病毒液分別接種4～8日齡健康易感仔豬，每頭皮下注射2.5 mL。接種72 h后剖殺，取血液和脾臟制成懸液接種原代地鼠腎細胞培養。將分離的病毒進行小鼠腦內致病力和皮下感染入腦試驗測其致病力，結果各代次病毒液經仔豬皮下傳1代，分離的病毒均與原毒株對小鼠致病力一致，毒力保持穩定不變。

2.3.3 選取 SA14－14－2疫苗株 F5代、F8代、F10代、F12代病毒培養液，測定小鼠半數保護劑量，依次為 103.43、103.35、103.05、103.28TCID50，結果表明不同代次病毒免疫原性保持穩定。

2.4 安全性檢測結果

2.4.1 三批豬乙型腦炎基礎種子分別進行小鼠腦內致病力試驗、小鼠皮下感染入腦試驗、小鼠毒性試驗和乳豬安全性檢驗，結果均合格。

2.4.2 將三批豬乙型腦炎基礎種子分別接種乙腦抗體陰性懷孕30 d初孕母豬，均未見疫苗接種引起的異常反應，懷孕期間無一例流產，死亡仔豬病毒分離為陰性，結果表明豬乙型腦炎基礎種子大劑量接種初懷母豬安全(表3)。

表3 大劑量接種初懷母豬的安全性試驗結果

3 討論與小結

豬乙型腦炎是由嗜神經性很強的乙腦病毒引起的臨床上神經癥狀嚴重的一種傳染病，因此研制活疫苗時首先要充分考慮疫苗株的安全性問題［3，8］。本文充分應用 SPF 級小鼠、初孕母豬、乳豬這三種敏感動物，通過小鼠腦內致病力、皮下感染入腦、大劑量接種初孕母豬和乳豬等試驗對三批基礎種子進行安全性驗證，結果表明三批基礎種子均對實驗動物無致病力，安全可靠。對SA14－14－2疫苗株F5代、F8代、F10代、F12代病毒培養液進行乳鼠傳代返祖和仔豬皮下傳代返祖等毒力穩定性試驗，結果表明疫苗毒株在傳代過程中毒力保持穩定，無返強現象，神經毒力回復的可能性相當低。

基礎種子以105.0TCID50劑量免疫后備母豬可使母豬獲得堅強的免疫力，耐受強毒攻擊，對胎兒進行乙腦病毒分離為陰性，充分證實母豬免疫后所產生的高水平特異性抗體阻止了胎盤感染。豬乙型腦炎病毒SA14－14－2疫苗株在原代地鼠腎細胞傳代至F12代，各代次病毒毒力和免疫原性保持穩定，但通過原代地鼠腎細胞傳代次數過多會影響疫苗免疫原性［9－10］，因此，在保證將來疫苗生產需要的前提下，生產用種子的傳代應控制在一定的范圍之內，本研究將其限定在F10代以內?？偠灾?，豬乙型腦炎SA14－14－2疫苗株基礎種子無外源病毒污染，具有可靠安全性和良好、穩定的免疫原性，可用于疫苗生產。

［1］俞永新.流行性乙型腦炎減毒活疫苗的發展和應用［J］.上海預防醫學雜志，2006，18(03):110－112.

［2］中華人民共和國農業部.中華人民共和國獸用生物制品規程二○○○年版［S］.

［3］徐滌平，劉澤文，楊宜生，等.豬乙型腦炎減毒活疫苗的安全性和免疫原性試驗［J］.中國獸藥雜志.2002，8:104－107.

［4］吳永林，劉杰，楊會強，等.乙型腦炎病毒減毒株SA14－14－2在乳鼠腦內連續傳代后病毒基因的變化［J］.中國生物制品學雜志.2007，1:19－21.

［5］李茂光，俞永新，劉欣玉，等.SA14－14－2株流行性乙型腦炎減毒活疫苗細胞免疫持久性研究［J］.中國疫苗和免疫.2010(04):214－218.

［6］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○一○年版三部［S］.

［7］賈麗麗，俞永新，黃鶯，等.流行性乙型腦炎減毒活疫苗生產毒種(SA14－14－2株)及其疫苗的表型和E基因穩定性研究［J］.中國生物制品學雜志.2004，1:13－16.

［8］賈麗麗，俞永新，Theodere F.Tsai，等.流行性乙型腦炎減毒活疫苗對國內外不同野毒株的免疫性［J］.中國生物制品學雜志.2000，13:208－210.

［9］賈麗麗，鄭錚，郭玉鵬，等.流行性乙型腦炎減毒活疫苗生產毒株(SA14－14－2)的穩定性研究［J］.中國生物制品學雜志.1992，4:174－176.

［10］許樂燕，徐聞青，徐帆洪，等.乙型腦炎病毒SA14－14－2減毒疫苗株的生物學和基因穩定性［J］.中國生物制品學雜志.2008，21(10):833－837.