乳酸乳球菌Lactococcuslactis1.2472 usp45基因的克隆與原核表達

葉 飛，李 昌，任大勇，，秦艷青，朱 翯，杜壽文，金寧一

（1.吉林農業大學動物科學與技術學院，吉林 長春 130118；2.軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，吉林 長春 130122；3.吉林農業科技學院生物工程學院，吉林 九站 132101）

近年來，微生態制劑應用于畜禽養殖受到廣泛關注。它能有效提高畜禽對病原菌的抵抗能力，改善畜禽健康狀況。乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）作為重要的益生菌在微生態制劑的開發中具有良好前景。

乳酸菌是一類能夠利用糖類代謝產生50%以上乳酸的細菌，主要分布于消化道和泌尿生殖道等部位，占消化道有益菌總量的50%以上[1-2]。研究表明，乳酸菌能夠恢復或增強腸道穩態，抑制病原菌侵染，促進消化吸收，增強宿主免疫功能[3-4]；近年來人們發現其與黏膜免疫系統相互作用，具備黏膜疫苗載體的潛能[5]。

乳酸菌胞外分泌蛋白，對于乳酸菌環境適應、細胞壁新陳代謝、通信以及定植宿主黏膜部位等方面具有重要作用[6-7]。對其的研究，能夠揭示乳酸菌如何適應黏膜局部環境，發揮益生功能改善宿主的微生態平衡。usp 45蛋白是本課題組從乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472培養物中發現的一種大量且穩定表達的胞外分泌蛋白。大量的組成型表達揭示其對于乳酸菌的環境適應及益生功能具有重要作用。本試驗從乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472基因組中克隆獲得usp45基因，并進行原核表達與純化，為進一步研究該蛋白的功能奠定基礎，進而為相關微生態制劑和黏膜免疫調節制劑的開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料 乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472、表達載體，pET-28a本室保存；克隆載體pMD18-T simple Vector、Ex-Taq酶、dNTP MIX、限制性內切酶BamH I、EcoR I，購自TaKaRa（大連）公司；E.coli DH 5α、E.coli BL21（DE3），購自北京全式金生物技術有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、小鼠Anti-His Antibody，購自TIANGEN生物公司；質粒DNA小量提取試劑盒，購自AxyGen（杭州）公司；Biospin凝膠回收試劑盒，購自BioFlux公司；Ni-NTA親和層析柱，購自QIAGEN公司；堿磷酶標記馬抗小鼠IgG，購自北京中杉金橋生物技術有限公司；IPTG/BCIP/NBT，購自Promega公司。

1.2 usp45基因的擴增 由usp 45基因（登錄號：M 60178.1）兩側特異性序列設計引物。序列為：FP：5′-ggggATCCATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTA（引入BamH I酶切位點）；RP：5′-gggAATTCCTA gtgatgatgatgatgatg-3′GTTTGGCATCAAGAAAG（引 入EcoR I酶切位點和His-tag標簽序列）。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

以乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472基因組DNA為模板，PCR擴增usp 45基因。反應條件：94℃，5 min；94℃變性30 S，58℃退火45 S，72℃延伸2 min，38個循環；72℃，10 min?；厥諗U增片段，連入克隆載體pMD18-T simple，獲得pT-usp 45質粒，轉化入E.coli DH 5α。BamH I/EcoR I雙酶切鑒定重組質粒，并送上海英濰捷基公司測序鑒定。

1.3 表達質粒的構建 pT-usp 45質粒與表達載體pET-28a經BamH I/EcoR I雙酶切，回收片段，T4連接酶16℃連接6 h。將連接產物轉化E.coli DH 5α。經BamH I/EcoR I酶切鑒定，獲表達質粒pET-28a-usp 45。

1.4 usp45的誘導表達 將pET-28a-usp 45轉入E.coli BL21（DE3），于LB（Kan+），37 ℃，220 r/min振蕩培養12 h。取50 μL菌液于5 mL LB（Kan+），220 r/min（37 ℃）振蕩培養2～3 h，至OD600值為0.6，加入IPTG至終濃度1.0 mmol/L，誘導表達5 h。

1.5 usp 45表達產物的SDS-PAGE分析 IPTG誘導表達的菌液經12 000 r/min離心3 min，收集上清與沉淀制備蛋白樣品。上清液：取1 mL冰浴，加入0.34 g（NH4）SO4，4℃靜置過夜后，12 000 r/min（4℃）離心25 min，收集沉淀，100 μL細菌裂解液懸起，即得“上清液蛋白樣品”。菌體沉淀：100 μL細菌裂解液懸起菌體沉淀，超聲波破碎（工作/間歇各15 s，25個循環），12 000 r/min離心10 min后，分別收集上清與沉淀，即得“破碎后上清蛋白樣品”與“破碎后沉淀蛋白樣品”。

上述蛋白樣品，“pET-28a”為空白對照，“pET-28a-usp45未誘導”為陰性對照，10%SDS-PAGE分析。

1.6 usp 45表達產物的Western blot分析 pET-28a為陰性對照，“破碎后沉淀蛋白樣品”（見1.5），經SDS-PAGE電泳，用半干轉移系統15 v，31 min轉移至硝酸纖維素膜。5%脫脂乳4℃封閉過夜，一抗（抗His小鼠IgG單抗）室溫孵育2 h，二抗（堿磷酶標記馬抗小鼠IgG）室溫孵育1.5 h，BCIP/NBT顯色，觀察結果。

1.7 usp 45表達產物的層析純化 制備“破碎后沉淀蛋白”（見1.5），利用usp 45蛋白尾部添加的His-tag標簽，由“Ni-NTA親和層析柱”按照操作說明，純化usp 45蛋白，并用SDS-PAGE鑒定。

2 結果與分析

2.1 usp45基因的PCR擴增結果 從乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472基因組，PCR擴增獲得usp 45基因，片段長1 371 bp（見圖1）。

2.2 克隆質粒pT-usp 45雙酶切鑒定與測序鑒定構建的克隆質粒pT-usp 45，經BamH I和EcoR I雙酶切可見1 371 bp的目的基因片段和2 671 bp的載體片段，與預期結果一致（見圖2）。測序結果顯示，pT-usp 45質粒中連接入usp 45基因?？寺≠|粒pT-usp 45構建成功。

2.3 表達質粒pET-28a-uusp 45的構建與鑒定BamH I和EcoR I酶切pT-usp 45質粒，獲得usp 45基因片段，連入表達載體pET-28a，獲得表達質粒pET-28a-usp 45。BamH I和EcoR I雙酶切可見1 371bp的目的基因片段和5 363 bp的載體片段，與預期結果一致（見圖3）。表達質粒pET-28a-usp 45構建成功。

2.4 usp 45表達產物的SDS-PAGE分析 pET-28a-usp 45轉化的E.coli BL21（DE3），經IPTG誘導表達5 h。超聲波破碎處理，獲得“上清液蛋白樣品”、“破碎后上清蛋白樣品”、“破碎后沉淀蛋白樣品”，用10%SDS-PAGE電泳分析（見圖4）。在“破碎后沉淀蛋白樣品”（泳道7）中有約50 kDa蛋白質分子的大量特異性誘導表達。表明目的蛋白表達成功。

2.5 usp 45表達產物的Western blot分析 “破碎后沉淀蛋白樣品”進行Western blot分析；pET-28a空質粒為陰性對照（見圖5）。結果顯示，重組菌誘導表達usp 45蛋白，usp 45基因原核表達成功。

2.6 usp 45表達產物的層析純化 “破碎后沉淀蛋白樣品”，用Ni-NTA親和層析純化，產物經SDS-PAGE分析（見圖6）。結果顯示，純化獲得約50 kDa蛋白質，即為usp 45蛋白。

3 討論

乳酸菌在動物黏膜部位發揮益生功能，涉及菌體之間、菌體與其他微生物之間、菌體與宿主黏膜部位細胞之間的相互作用。乳酸菌胞外分泌蛋白在此發揮影響作用。對于乳酸菌胞外分泌蛋白的研究，能夠更好理解乳酸菌在腸道內定植的規律；了解其與腸道其他菌群相互作用關系；了解其與宿主胃腸道黏膜細胞相互作用關系[7-9]。

本實驗室從乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472培養物中發現一種較大量組成型表達的胞外分泌蛋白。經質譜鑒定與Blast同源分析表明，其即為usp 45蛋白（結果未發表）。穩定的高表達預示其對于乳酸菌的基本生理功能以及乳酸菌與環境、宿主的相互作用具有潛在的重要功能。本試驗從乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472基因組中擴增獲得usp 45基因，構建了原核表達質粒pET-28a-usp45，成功進行了原核表達及純化，為進一步研究usp45蛋白在乳酸菌發揮益生功能中的作用奠定了良好基礎。

[1]Vaughan E E，de Vries M C，Zoetendal E G，et al.The intestinal LABs[J].Antonie Van Leeuwenhoek，2002，82（14）:341-352.

[2]Klaenhammer T R，Altermann E，Pfeiler E，et al.Functional genomics of probiotic Lactobacilli[J].J Clin Gastroenterol，2008，42（2）:160-162.

[3]Banjoko I O，Adeyanju M M，Ademuyiwa O，et al.Hypolipidemic effects of lactic acid bacteria fermented cereal in rats[J].Lipids Health Dis，2012，11：170.

[4]Berlec A，Ravnikar M，Strukelj B.Lactic acid bacteria as oral delivery systems for biomolecules[J].Pharmazie，2012，67（11）:891-898.

[5]Chatel J M，Langella P，Adel-Patient K，et al.Induction of mucosal immune response after intranasal or oral inoculation of mice with Lactococcus lactis producing bovine beta-lactoglobulin[J].Clinical and diagnostic laboratory immunology，2001，8（3）:545-551.

[6]Van Baarlen P，Troost F J，van Hemert S，et al.Differential NF-kappaB pathways induction by Lactobacillus plantarum in the duodenum of healthy humans correlating with immune tolerance[J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（7）：2371-2376.

[7]Raimann E，Schmid B，Stephan R，et al.The alternative sigma factor sigma of L.onocytogenes promotes growth under diverse environmental stresses[J].Foodborne Pathog Dis，2009，6（5）:583-591.

[8]Zhou M，Boekhorst J，Francke C，et al.Locate P:genome-scale subcellular-location predictor for bacterial proteins[J].BMC Bioinformatics，2008，9：173.

[9]Martien van Asseldonk，Ger Rutten,Marco Oteman，et al.Cloning of usp45，a gene encoding a secreted protein from Lactococcus lactis subsp.Lactis MG1363[J].Gene，1990，95（1）:155-160.