臍帶間充質干細胞nestin mRNA表達的研究

侯吉鋒，姚星宇，張國華，趙鵬偉，楊麗敏

(內蒙古醫科大學附屬醫院，呼和浩特010059)

研究發現，臍帶中含有豐富的造血及間充質干細胞(MSCs)。神經巢蛋白(nestin)是一種中等纖維蛋白，在哺乳動物神經前體細胞中高表達，是神經前體細胞的標志分子，目前已有關于經定向誘導的臍帶間充質干細胞(UC-MSCs)表達神經細胞特有抗原或相關因子的研究報道［1，2］。為探討未經誘導的臍帶MSCs中是否存在神經前體細胞標志物基因表達及其意義，我們于2013年5～12月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 根據中華人民共和國國務院頒發的《醫療機構管理條例》，經本院倫理委員會批準，實驗前告知對方實驗方案及風險，產婦家屬簽署自愿捐獻臍帶志愿書后，由婦產科醫師采集10名健康足月兒的臍帶(產婦均無傳染病)主要試劑及設備:DMEM/F12(美國GIBCO)，胎牛血清(美國GIBCO)，雙抗(青霉素+鏈霉素，美國GIBCO公司)，臺盼藍(Sigma)，PBS(天津化學試劑廠)，倒置相差顯微鏡(Olympus)，熒光顯微鏡(Nikon)，高速離心機(RJ-TGL-16B)，層流超凈工作臺(YJ-1450蘇州凈化設備廠)，CO2細胞培養箱(日立)，0.22 μm 微孔濾膜濾器(美國 Millipore)，25 cm2細胞培養瓶(美國Lincoln)。nestin mRNA引物，由TaKaRa公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 臍帶MSCs分離、培養及鑒定 取無菌新鮮臍帶標本3 cm，以PBS(pH7.4)反洗清洗并沖洗多次，抽掉血管，剪碎臍帶組織，以膠原酶37℃消化2 h，2 500 r/min 離心 10 min，取下層沉淀，以 0.25%胰蛋白酶37℃消化20 min，2 500 r/min離心10 min，取沉淀部分，以PBS吹打使懸浮，100 μm的濾網進行過濾，收集濾過液以2 000 r/min離心10 min，取沉淀部分，以PBS洗滌細胞3遍，每遍1 000 r/min離心 10 min，以 1×105/L的密度接種于DMEM培養基(培養體系為DMEM/F12+10%胎牛血清+雙抗)中，置于37℃、5%CO2和100%濕度培養箱培養，每3～4 d半量換液1次，細胞接近80%融合時用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞;采用流式細胞儀鑒定MSCs(MSCs不表達造血干細胞的表面特征，而表達 MSCs的標志，即CD44、CD90及CD105陽性，而 CD34、CD45及 HLA-DR 呈陰性)。傳代培養至第六代細胞。

1.2.2 臍帶MSCs形態及活性觀察 細胞行臺盼藍染色倒置相差顯微鏡觀察細胞形態，計數活細胞，活細胞率 =活細胞數/細胞總數×100%。

1.2.3 臍帶MSCs nestin mRNA表達檢測 采用實時定量PCR法分別檢測臍帶MSCs原代細胞及第1代、第2代細胞的nestin mRNA表達。引物設計與合成:Nestin引物根據GenBank公布的基因序列，采用引物設計軟件Primer5.0設計。cDNA提取:取未培養的原代細胞與培養傳代后的第1代、第2代細胞各3×105個作為樣本。根據TaKaRa公司的Trizol總RNA提取試劑盒提取 RNA。將8 μL的RNA加入反轉錄體系合成cDNA，其中5×Prime-Script RT Master Mix(Perfect Real Time)2 μL，總反應體系為10 μL。置入PCR儀中反轉錄，反轉錄條件:37 ℃、15 min，85 ℃、5 s。采用 SYBR Premix Ex TaqⅡ熒光染料法進行實時定量PCR擴增。PCR反應體系為20 μL，包括 SYBR premix Ex TaqⅡ(2 ×)10 μL、PCR Forward Primer 0.8 μL、PCR Reverse Rrimer 0.8 μL、ROX Reference Dye(50 × )or DyeⅡ(50 × )0.4 μL、template 2 μL、蒸餾水 dH2O 6 μL;置于實時熒光定量PCR儀中擴增，反應條件:95℃預變性30 s;95℃變性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸10 s，循環35次后，72℃延伸10 min。反應結束后直接得到結果，即nestin和管家基因β-actin的ΔCT值，將ΔCT值進行運算得到均值后，再以nestin的 mean ΔCT 除以管家基因 β-actin 的 meanΔCT，得到的數值即為此樣本nestin mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1 臍帶MSCs形態及活性 每根臍帶分離到的MSCs為(4.12～6.35)×105個/L，細胞活性為96.63%～99.70%。倒置相差顯微鏡觀察，新鮮分離出的MSCs胞體呈圓形，接種約48 h左右，約1/4的細胞由圓形變為梭形，細胞開始貼壁;72 h后貼壁細胞數量逐漸增多，細胞形態發生明顯變化，呈長梭形，排列緊密;7～8 d后梭形細胞數大量增加，細胞趨向簇狀生長;培養10 d后，可見1～2個/HP胞體較大、有數個放射狀突觸的神經樣細胞，且形態各不相同，見圖1。培養第30 d(傳代至第5代)，細胞呈不規律生長，無法從形態判斷。

圖1 培養中成簇狀生長和放射樣生長的MSCs

2.2 臍帶MSCs nestin mRNA表達 見圖2。未培養的原代細胞及傳代細胞nsetin mRNA均呈陽性表達，原代細胞snestin mRNA相對表達量為2.64±0.42，第1代細胞為 1.71 ±0.19，第 2 代細胞為0.26 ±0.06。

圖2 臍帶MSCs nestin mRNA表達

3 討論

國內外研究表明，臍帶中的MSCs總量高于血、羊水等組織［3～5］，與骨髓血中提取的 MSCs極為相似，同樣具備多向分化的潛能［6～8］，各國學者關于MSCs分化的機制有許多迥然不同的學說，至今仍然無統一明確的結論［9，10］。nestin屬于第Ⅵ型中間絲纖維蛋白，最初被發現普遍存在于神經前體細胞，在增殖能力強、尚未分化的神經前體細胞中高度表達，可調節細胞增殖、分化成熟［11，12］。nestin 在所有中樞神經系統干細胞中均有表達，目前被廣泛作為鑒定中樞神經系統干細胞的標記物，以區別分化的神經細胞。然而在很多組織中nestin也有表達，如發育中的肌肉組織、新形成的內皮細胞、胰腺導管的上皮細胞、肝臟的星型細胞等［13］。研究發現，nestin只在一段特定的時間段內表達，然后逐漸減少，最后分別被已分化成神經元的特異中間纖維和星形膠質細胞的膠質纖維酸性蛋白(GFAP)取代［14］。

本研究發現，臍帶MSCs呈nestin mRNA陽性表達，其表達量在傳代后有明顯減少。但表達量的減少并不意味著細胞中神經前體細胞數量的減少，首先，上述變化特點與nestin蛋白在神經前體細胞向神經細胞分化時的變化是一致的;其次，這種變化可能與細胞的橫向分化有關，有報道稱干細胞具有橫向分化特性，造血干細胞在一定條件下也可橫向分化為神經干細胞［15］，這種不可預測的分化趨勢有可能影響nestin mRNA的表達。所以，nestin mRNA表達量的減少可能是上述兩種因素的單一或者共同作用。本研究所用基因序列為nestin mRNA引物，可確定這些nstin mRNA表達陽性的細胞中含有神經前體細胞，但其移植后在活體內是否適合作為種子細胞而發揮功能還有待于進一步研究觀察。

姚星宇等［16］報道在經誘導的臍血單核細胞中可發現神經樣細胞，我們在前期研究發現，相比較而言，如果是相同數量的臍帶源細胞與臍血源細胞，臍帶中神經樣細胞數量較臍血更為豐富，可能與臍血中MSCs含量過少有關。本研究發現，臍帶細胞培養8 d后可見少數放射狀突起的類似神經樣細胞的生長形態，這些突起的形態類似于軸突、樹突，傳代后仍有類似細胞的出現，但是在傳代5次以后，大部分細胞呈上皮樣生長或者不規則形態生長，很難再找到神經樣細胞，這些神經樣細胞除了有放射狀突起外，形態各不相同，表明部分MSCs可成長為神經樣細胞，不排除MSCs自發分化為神經前體細胞的可能，但這些神經樣細胞移植后是否能發揮神經元的功能并不可知。

綜上所述，新鮮的臍帶組織分離培養的原代細胞有nestin mRNA表達，且傳代后該基因仍有表達，提示其存在分化為神經細胞的潛能;盡管傳代后表達量有所減少，但仍可作為穩定可靠的細胞供體;同時發現部分MSCs培養時可能出現形態各異的類神經樣細胞，說明臍帶MSCs中可能存在神經前體細胞，其有可能成為治療神經系統疾患的種子細胞之一。目前干細胞移植仍有許多不成熟及疑惑之處，首先，未經誘導的MSCs中神經樣細胞數量極少，不能達到治療目的;其次，植入體內的干細胞中nestin基因表達是否會被抑制尚不可知，需動物實驗進一步證實。

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