Notch1 siRNA對小鼠惡性黑色素瘤細胞體內外增殖的抑制作用研究

齊艷霞，康世均，劉新會，羅榮城

(南方醫科大學中西醫結合醫院，廣州510315)

惡性黑色素瘤(Malignant Melanoma，MM)為惡性程度較高的腫瘤，該病起病隱匿，易轉移且病死率高，治療棘手。研究發現，Notch信號通路不僅對正常細胞的分化起作用，而且可影響腫瘤細胞的增殖、分化及凋亡。Notch1是Notch的4個受體之一，近年來證實其間接參與了黑色素細胞的早期惡變［1］。RNA干擾是由雙鏈RNA引發的誘導轉錄后基因沉默的過程，能特異性抑制與腫瘤發生發展相關的基因表達。目前靶向Notch1基因小干擾RNA(Notch1 siRNA，以下簡稱siNotch1)，抑制腫瘤細胞生長的作用已在膠質瘤、腎癌、宮頸癌等疾病的研究中得到了證實［2～4］。2013年4～11月，我們觀察了對小鼠MM細胞體內外生長的抑制作用?，F分析結果，探討siNotch1治療MM的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物:C57BL/6小鼠，雌性，6～8周齡，體質量18～22 g，購自南方醫科大學動物實驗中心，SPF級環境中飼養;細胞系:小鼠MM細胞株B16F1由美國芝加哥大學孟玉茹教授贈與;主要試劑:PrimeScript?RT reagent試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒購自TaKaRa公司;Notch1及β-actin抗體購自 Santa Cruz公司;Trizol、Lipofectamine2000、Notch1及β-actin引物購自Invitrogen公司;PVDF膜和化學發光液購自 Pierce公司;胎牛血清、高糖DMEM培養基購自美國HyClone公司;siNotch1 Oligo及陰性對照購自上海吉瑪生物公司;HRP標記的兔抗山羊二抗試劑盒(PV-9003)購自北京中衫金橋生物公司;MTT試劑盒、DMSO購自Sigma公司。

1.2 體外實驗

1.2.1 細胞培養 B16F1細胞株用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液培養，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱內，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，每2～3 d傳代一次。

1.2.2 siNotch1的設計與合成 siNotch1的設計合成由上海吉瑪生物公司完成，前期從預先設計的6對序列中選出1對作為目的siRNA，序列為:siRNANotch1-mus-4650，正義鏈:5'-GCAACCUGCAGUGUAAUAATT-3'，反義鏈 5'-UUAUUACACUGCAGGUUGCTT-3'。同時選取與Notch1 mRNA及其他基因均無同源性的siRNA(siNC)作為陰性對照。

1.2.3 細胞瞬時轉染 用Lipofectamine2000轉染技術轉染細胞。轉染前1天，消化收集B16F1細胞，接種至6孔板中。第2天，當細胞達30%～50%融合時，分別將siNotch1及siNC轉染入B16F1細胞中。細胞轉染后于溫箱內無血清培養4 h，更換完全培養基，用于后續實驗。細胞分為siNotch組、siNC組和只加轉染試劑對照的mock組。

1.2.4 細胞Notch1 mRNA及蛋白表達檢測 分別采用RT-PCR和Western blot法。轉染后24 h，TRIzol提取總 RNA，計算各組 RNA濃度和純度，總RNA(1μg)在20 μL體系中去除基因組DNA，進行逆轉錄反應:42 ℃、60 min，95 ℃、5 min，4℃、5 min。熒光定量PCR:將反應管置入LightCycler480 RTPCR 系統中，反應條件為 95℃、30 s，95℃、5 s+60℃、20 s(40個循環)，監測熒光信號，相對定量結果參考 ΔΔCT方法計算。Notch1引物正義鏈:5'-TCAATGTTCGAGGACCAGATG-3'，反 義 鏈:3'-TCACTGTTGCCTGTCTCAAG-5'。轉染后72 h采用Western blot法檢測各組Notch1蛋白表達:①提取細胞蛋白質采用BCA法定量，計算總蛋白濃度;②蛋白質凝膠電泳后轉膜;③室溫封閉1 h，加山羊抗小鼠Notch1抗體，4℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育1 h;④采用化學發光檢測Notch1蛋白表達并進行灰度分析。

1.2.5 細胞克隆形成試驗 各組細胞消化后按100個/孔接種于6孔板內，培養14 d，當出現肉眼可見的點狀細胞克隆時，終止培養，甲醛固定、干燥、結晶紫染色;顯微鏡下行克隆計數(≥50個細胞為一個克隆)，克隆形成率=形成克隆的數目/接種細胞的數目×100%。

1.2.6 細胞增殖能力檢測 各組細胞轉染后，以800個/孔接種于96孔板中常規培養，分別于0、24、48、72 h采用MTT法檢測細胞增殖能力。檢測時每孔按1 mg/mL加入MTT溶液，培養4 h，棄去培養液，每孔加入DMSO 150 μL，酶標儀測定每孔吸光度(OD)值。

1.3 體內實驗

1.3.1 小鼠MM 模型制作 將15只C57BL/6雌性小鼠隨機分為siNotch組、siNC組及mock組，每組各5只;分別選取相應的轉染細胞及未轉染的B16F1細胞，于每只小鼠皮下注射100 μL細胞懸液(1×106個/mL)。轉染后，觀察各組腫瘤生長情況并測量體積(V)。V=(ab2)/2(a為腫瘤長徑;b為腫瘤寬徑)，繪制腫瘤生長曲線。腫瘤體積達100～150 mm3時(細胞接種后第10 d)為維持穩定的轉染效果，siNotch組、siNC組注射相應的 siRNA(50 μg ，25 μL/只)或 PBS(25 μL/只)，每周 2 次，共 7次。轉染后28 d斷頸處死小鼠，取腫瘤標本比較各組腫瘤體積。

1.3.2 腫瘤組織病理學觀察及Notch1蛋白表達測定 4%多聚甲醛固定上述三組腫瘤組織，常規制成石蠟切片，HE染色觀察病理改變;同時切片予脫蠟、水化、抗原修復，免疫組化法觀察腫瘤細胞Notch1蛋白表達情況。Notch1表達于細胞質和細胞膜，呈棕黃色染色為Notch1蛋白陽性表達。結果采用雙盲法判定，每張切片隨機選擇5個高倍視野(400×)，每個視野計數100個細胞，計算陽性細胞所占百分比。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件行統計學處理。實驗數據采用±s表示，采用單因素方差分析、析因方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體外實驗

2.1.1 細胞Notch1基因及蛋白表達水平 siNotch組、siNC組和mock組 Notch1 mRNA表達水平分別為0.14 ± 0.01、0.96 ± 0.05、1.00 ± 0.03，siNotch組、siNC組顯著低于 mock組(F=634.84，P ＜0.01)，siNotch組、siNC組和 mock組 Notch1蛋白表達水平分別為 0.31 ± 0.01、1.00 ± 0.04、1.02 ±0.03，siNotch組、siNC 組顯著低于 mock組(F=536.69，P ＜0.01)。

2.1.2 細胞克隆形成情況 siNotch組、siNC組和mock 組細胞克隆形成率分別為0.16 ±0.02、0.76 ±0.03、0.79 ±0.03，siNotch 組顯著低于 siNC 和 mock組(F=504.02，P ＜0.01)。

2.1.3 細胞增殖能力 從轉染的第2天開始，si-Notch組增殖速度顯著慢于siNC組和mock組(P＜0.01)，且細胞增殖受到明顯抑制。各組細胞增殖情況見圖1。

圖1 各組細胞增殖情況

2.2 體內實驗

2.2.1 腫瘤生長情況 各組腫瘤生長曲線如圖2。由圖2可見，siNC組及mock組腫瘤生長曲線較為一致，且生長速度明顯快于siNotch組;從轉染第17天開始，siNotch組生長速度明顯小于另兩組(F=24.24，P ＜0.01)。第 31天處死小鼠測量腫瘤體積，siNotch組、siNC組及mock組腫瘤體積分別為(1 307.95 ± 161.91)、(2 970.68 ± 140.95)和(3 078.99 ±252.26)mm3，siNotch 組顯著小于另兩組(F=134.74，P ＜0.01)。

圖2 各組腫瘤生長曲線

2.2.2 腫瘤組織病理學變化及Notch1表達 轉染后第31天，siNotch組腫瘤組織鏡下見多處大片壞死灶，腫瘤細胞異型性不明顯，siNC組及mock組腫瘤細胞異型性明顯，組織中含豐富的新生血管，壞死灶較少。siNotch組、siNC組及mock組Notchl蛋白陽性細胞百分率分別為41.44% ±6.84% 、87.20%±4.53%、90.36% ±5.25%，siNotch 組明顯低于另兩組(F=592.78，P ＜0.01)。

3 討論

1916年，Morgan 等［5］首次發現 Notch信號蛋白，因其部分喪失功能的突變體可在果蠅翅膀的邊緣造成缺口(Notch)而得名，1983年成功克隆出果蠅的Notch基因。研究表明，Notch信號通路與細胞分化和腫瘤的發生發展密切相關，可能扮演著原癌基因的角色。Notch通路激活是通過Notch受體與相鄰細胞表面的配體結合，引起Notch受體細胞外結構的改變，導致γ-分泌酶復合體切割，釋放Notch受體胞內區(NICD)進入細胞核，NICD與CSL蛋白結合導致共抑制復合物解離，并募集共活化分子MAML1組成共三聚體，從而啟動下游基因的轉錄。在哺乳動物中，Notch是由4個受體(Notch1～Notch4)及5個配體組成，目前已經發現多種人類腫瘤的發生發展與其中的Notch1表達異常有直接關系［6］，Massi等［1，7］也證實 Notch1 在人 MM 細胞中呈高表達。為探索治療MM的新途徑，研究者們試圖通過多種方法阻斷Notch通路，如干擾Notch共活化因子MAML1、阻斷其配體與受體的結合等［8］，研究較多的γ-分泌酶抑制劑不僅可阻斷Notch受體，且可阻斷Notch配體以及其他蛋白酶的生理功能，但其有一定毒性［9］，臨床應用受限。

RNA干擾技術是近年來基因表達調控的研究熱點之一，己成為研究基因功能、表達調控及識別復雜調控信號通路的有效工具，在基因治療中具有很高的應用價值;但其作用時間短，轉染的siRNA在細胞中的作用僅能維持5～7 d［10］。為此我們在動物皮下成瘤后每3～4 d進行一次siNotch1瘤內注射，以保證穩定的轉染效果。

本研究結果表明，siNotch1轉染細胞的增殖能力與克隆形成明顯受到抑制，siNotch組腫瘤生長速度明顯慢于另兩組;免疫組化結果提示，腫瘤細胞生長受抑制程度與腫瘤組織內Notch1蛋白表達受抑制程度呈正相關。證實siRNA干擾技術體內外均可抑制B16F1細胞生長;其作用機制可能為抑制Notch1基因與蛋白表達。Notch1可能是人MM基因治療的侯選靶點。

［1］Massi D，Tarantini F，Franchi A，et al.Evidence for differential expression of Notch receptors and their ligands in melanocytic nevi and cutaneous malignant melanoma［J］.Mod Pathol，2006，19(2):246-254.

［2］Sjolund J，Johansson M，Manna S，et al.Suppression of renal cell carcinoma growth by inhibition of Notch signaling in vitro and in vivo［J］.J Clin Invest，2008，118(1):217-228.

［3］Rose SL，Kunnimalaiyaan M，Drenzek J，et al.Notch 1 signaling is active in ovarian cancer［J］.Gynecol Oncol，2010，117(1):130-133.

［4］Wang J，Wang C，Meng Q，et al.siRNA targeting Notch1 decreases glioma stem cell proliferation and tumor growth［J］.Mol Biol Rep，2012，39(3):2497-2503.

［5］Morgan MM，Mahowald AP.Multiple signaling pathways establish both the individuation and the polarity of the oocyte follicle in Drosophila［J］.Arch Insect Biochem Physiol，1996，33(3-4):211-230.

［6］Nickoloff BJ，Osborne BA，Miele L.Notch signaling as a therapeutic target in cancer:a new approach to the development of cell fate modifying agents［J］.Oncogene，2003，22(42):6598-6608.

［7］Balint K，Xiao M，Pinnix CC，et al.Activation of Notch1 signaling is required for beta-catenin-mediated human primary melanoma progression［J］.J Clin Invest，2005，115(11):3166-3176.

［8］Kang S，Xie J，Miao J，et al.A knockdown of Maml1 that results in melanoma cell senescence promotes an innate and adaptive immune response［J］.Cancer Immunol Immunother，2013，62(1):183-190.

［9］Panelos J，Massi D.Emerging role of Notch signaling in epidermal differentiation and skin cancer［J］.Cancer Biol Ther，2009，8(21):1986-1993.

［10］Holen T，Amarzguioui M，Wiiger MT，et al.Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger Tissue Factor［J］.Nucleic Acids Res，2002，30(8):1757-1766.