肝細胞癌組織中信號素3F蛋白表達變化及其與患者預后的關系

羅來邦，徐志丹，丁利民，羅文峰，龍成美，張友福，李新長

(江西省人民醫院，南昌330006)

肝細胞癌(HCC)作為一種富血管的實體瘤，新生血管的生成對其發生發展及侵襲轉移都是必不可少的。信號素3F(SEMA3F)蛋白最初作為一種抑癌基因在肺癌中被發現，目前在多種腫瘤組織中都觀察到了SEMA3F基因缺失或SEMA3F蛋白水平下調［1，2］，SEMA3F 能夠抑制腫瘤的血管生成和侵襲轉移［3，4］。但是國內外有關 SEMA3F 基因與 HCC復發轉移的關系的相關研究鮮見。2008年5月～2011年9月，我們觀察了32例HCC患者癌組織SEMA3F基因表達情況，現分析結果，探討其在HCC發生發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 研究對象為2008年5月～2009年9月江西省人民醫院經手術病理確診的32例HCC患者，男29例、女3例，年齡22～70歲，中位年齡47歲;術前均未行介入治療以及放、化療。乙肝表面抗原陽性28例，陰性4例;有肝硬化者25例。取32例患者的手術切除標本(腫瘤有包膜結構者16例，無包膜結構者16例;腫塊為單結節者16例，結節數≥2個者16例)，于腫瘤分界線靠腫瘤側1 cm內取樣為HCC組，分界線另一側1 cm取癌旁組織作為對照組。全部標本離體后迅速取材，置入液氮速凍后轉入超低溫冰箱-70℃保存備用。

1.2 兩組SEMA3F蛋白表達檢測 采用Western blot法，操作按試劑盒說明書進行。按照說明書配制并加入Super Singnal發光試劑顯影曝光攝片;所得圖像掃描后用圖形分析軟件(Quantity One)進行圖像分析。以出現Quantity One軟件可識別的蛋白條帶為SEMA3F蛋白表達陽性;其表達量以蛋白條帶吸光度和條帶面積乘積表示。癌組織與癌旁組織SEMA3F蛋白表達量之比＜0.48為低表達，≥0.48為高表達。分析SEMA3F蛋白表達與HCC臨床病理特征的關系。

1.3 SEMA3F蛋白表達與腫瘤復發及生存時間的關系的觀察 對32例患者采用門診定期復查、電話、信訪等方式隨訪，自術后開始，截止日期為2011年9月(全部獲得隨訪)計算術后生存時間以及復發時間，患者死亡或失訪定為隨訪結束點。分析SEMA3F蛋白表達與術后復發及生存時間的關系。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗。計數資料的組間比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法。采用Kapan-Meier法計算術后復發轉移率和術后生存率，用Log-rank法比較兩組術后復發轉移率和術后生存率的差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SEMA3F蛋白表達 HCC組及對照組 SEMA3F蛋白表達陽性率分別為84%(27/32)、97%(31/32)，差異無統計學意義;SEMA3F蛋白表達量分別為 447.8 ±48.3、618.9 ±61.2;P ＜0.05。32 例患者SEMA3F蛋白高表達者17例，低表達者15例。

2.2 SEMA3F蛋白表達與HCC臨床病理特征的關系 腫瘤有、無包膜者SEMA3F蛋白表達量分別為388.3 ±97.1、254.6 ±61.4，有、無肝硬化者分別為509.6 ±70.1、226.9 ±88.6，單個、多個結節者分別為572.4 ±103.1、323.1 ±52.9。腫瘤有包膜結構者表達量明顯高于無包膜結構者，腫瘤為單個結節者表達量明顯高于多結節者(P均＜0.05)。有、無肝硬化者SEMA3F蛋白表達量差異無統計學意義。

2.3 SEMA3F蛋白表達與HCC復發及預后的關系17例SEMA3F蛋白高表達者及15例低表達者術后各時點復發率見圖1，生存時間見圖2。由圖可見，低表達者復發率顯著高于高表達者，生存時間顯著短于高表達者(P均＜0.05)。

圖1 HCC組SEMA3F蛋白低、高表達患者術后復發率比較

圖2 HCC組SEMA3F蛋白低、高表達患者術后生存率比較

3 討論

HCC惡性程度極高，具有高度的侵襲轉移性，極易發生肝內外的轉移。隨著肝臟外科手術技術的提高以及圍手術期處理的不斷完善，HCC的手術切除率大大提高［5］;但盡管如此，患者的預后情況仍沒有根本的改善。術后復發和轉移為主要原因［6，7］。肝癌復發轉移是多步驟、多種生理及病理因素參與的復雜過程，腫瘤血管生成是其中一個重要步驟［8～11］。SEMA3F 是一種抑癌基因［12］。隨著研究的深入，逐步發現其能通過多條途徑抑制新生血管的形成;在抑制血管內皮細胞活化、增殖和運動方面均有重要作用。研究發現，在內皮細胞培養時加入外源性的SEMA3F能夠有效抑制血管內皮細胞活化以及增殖［3］;SEMA3F對于血管內皮細胞存在一種化學排斥作用［4］，將分泌SEMA3F的腫瘤細胞和SEMA3F共同培養時，腫瘤細胞周圍的內皮細胞被逐漸排開，形成一個空區;將含有SEMA3F基因的質粒轉入黑色素瘤細胞，并將細胞植入裸鼠皮下，所形成的腫瘤的微血管數目和侵襲轉移能力大大降低。SEMA3F對于血管內皮細胞的作用方式不僅僅局限于其直接影響血管內皮細胞的活化、增殖和定向移動，更能夠拮抗一部分促進血管生成的因子的作用。VEGF是目前已知的最強的血管生成促進因子，SEMA3F能夠通過直接競爭性的結合其受體—神經纖毛蛋白Neuropilins，抑制VEGF誘導血管生成的信號通路上的效應分子細胞外調節激酶(ERK)的磷酸化，抑制 VEGF所誘導的血管生成［13］。

HCC是典型的富血供惡性腫瘤，臨床實踐中我們發現存在一種孤立性大肝癌(SLHCC)，其特點是直徑＞5 cm，并有完整的包膜或包膜狀結構，具有較好的生物學行為，腫瘤內部血管密度較結節性肝癌低，侵襲轉移率也較低，患者預后相對較好［14，15］。這些特點與SEMA3F在其他腫瘤如黑色素瘤中的作用不謀而合。故我們選擇SEMA3F作為研究指標，了解其與HCC的臨床病理特征，復發轉移及預后的關系。

本研究結果顯示，HCC癌組織與癌旁組織SEMA3F表達陽性率無顯著差異，這與先前發現的SEMA3F在人體內表達較為廣泛的特點是一致的。在對表達量的統計分析中我們發現，癌組織SEMA3F蛋白表達量低于癌旁組織，表明SEMA3F蛋白表達在HCC中產生了明顯的下調。

研究發現，SEMA3F所在的染色體3p21.3區段在肺癌、腎癌、乳腺癌，卵巢癌以及鼻咽癌中都存在高頻的雜合性缺失［1，2］;在這些腫瘤中 SEMA3F 的表達均有不同程度的下調。在對SEMA3F同家族成員SEMA3B的研究中也發現，在肝癌組織中染色體3p21.3區段同樣存在有一定程度的雜合性丟失［16］，這一發現是SEMA3F作為一種抑癌基因的有力佐證。SEMA3F蛋白在HCC中表達下調的原因，不僅僅在于其所在染色體區段的雜合性丟失，也可能是腫瘤細胞中存在的其他細胞因子影響了SEMA3F所在的信號傳導通路所致;例如VEGF能夠與SEMA3F競爭同一受體Neuropilins。盡管目前二者優先與Neuropilins結合的條件和機制尚不完全清楚，但可以肯定的是，當VEGF表達水平升高時，SEMA3F的表達明顯降低［10］。究其原因，可能是VEGF與Neuropilins結合后阻止了SEMA3F對Neuropilins的作用，游離的SEMA3F蛋白被分泌在細胞外基質中，被基質內的蛋白酶迅速降解。VEGF在肝癌中呈過量表達，這也可能是SEMA3F蛋白在HCC組織中表達下調的原因之一。

腫瘤包膜的形成機制目前仍無定論，但大多數學者都傾向于“膨脹學說”，即包膜并非來源于腫瘤本身，而是腫瘤在膨脹性生長中，對周圍組織的擠壓造成組織缺血，慢性炎癥后繼發修復伴隨細胞外基質沉積而形成［17，18］。包膜是機體抑制腫瘤侵襲轉移的重要屏障，具有包膜結構的腫瘤常常有著良好的生物學行為和預后。本研究結果顯示SEMA3F蛋白高表達與包膜形成顯著相關。這一相關性可以用SEMA3F對血管生成的抑制作用來解釋。腫瘤細胞產生的SEMA3F對內皮細胞的化學排斥作用阻止了內皮細胞由腫瘤周圍組織向腫瘤內部的遷移，同時抑制了腫瘤內部的血管內皮細胞的活化與增殖，導致腫瘤血管形成的減少;腫瘤因此難以得到充分的營養，生長緩慢，故只能向周圍組織膨脹性生長而非浸潤性生長;由于腫瘤擠壓周圍的肝組織，引起慢性炎癥并繼發纖維修復和膠原沉積，形成包膜結構。由此可見，包膜或包膜結構既是機體阻止腫瘤發生侵襲轉移的重要屏障，也是腫瘤具有良好生物學行為的標志。Bielenberg等［4］將含SEMA3F基因的質粒轉入高侵襲轉移能力的黑色素瘤細胞中，并將轉染后穩定表達SEMA3F蛋白的細胞進行裸鼠成瘤試驗。結果發現，轉染后的黑色素瘤細胞所形成的腫瘤均具有完整的包膜結構。

結節性肝癌除可能為多中心發生外，常常是肝內轉移所致［19］。本研究顯示，單個結節的HCC組織中SEMA3F表達量高于多結節HCC。通過門脈系統擴散是HCC肝內轉移的主要途徑，SEMA3F蛋白在單個、多個結節HCC中表達的差異提示其在抑制HCC肝內轉移中起到重要作用;肝外轉移同樣也是導致HCC患者預后不良的原因之一。但在臨床病例中，大多數已有肝外轉移的患者不再選擇手術治療，因此從已有肝外轉移的HCC組織中檢測SEMA3F蛋白在標本采集上有一定的困難。已有研究顯示，SEMA3F能夠降低惡性腫瘤的轉移率［9］。結合以上兩個方面的研究結果，單個、多個結節HCC中SEMA3F蛋白表達的差異為單個結節HCC可能具有相對良好的生物學行為提供了新的證據。

值得提出的是，SEMA3F蛋白對血管生成抑制作用的主要靶點是血管內皮細胞;而以往對SEMA3F作用于血管內皮細胞的研究所采用的都是外源性的SEMA3F蛋白。這兩個特點使得SEMA3F蛋白具有了成為一種抑制血管生成藥物的可能。首先，血管內皮細胞暴露于血液中，進入血液循環的藥物能夠很輕易的作用于這些靶點;其次，外源性的SEMA3F蛋白能夠抑制血管內皮細胞的活化、增殖、趨化、運動和聚集。如能將人工合成的SEMA3F導入腫瘤細胞中，使腫瘤細胞自身能夠分泌高水平的SEMA3F蛋白，則有可能改變惡性腫瘤的侵襲轉移性。由此可見，SEMA3F無論是作為一種傳統的藥物或是腫瘤基因治療的研究熱點都有著很好的前景。當然，要將SEMA3F作為一種抗血管生成的藥物應用于臨床，還必須克服很多難題，比如如何消除SEMA3F對其他正常器官的副作用等。

本研究隨訪資料顯示，SEMA3F蛋白低表達者生存時間顯著短于高表達者，復發率顯著高于高表達者。表明SEMA3F蛋白低表達可促進HCC復發、轉移;SEMA3F可作為預警HCC復發轉移的有價值的標志物。理論上SEMA3F作為一種分泌型蛋白應能從外周血中檢測到，此為臨床通過檢測SEMA3F蛋白來判斷患者的預后提供了便利的條件。

綜上所述，SEMA3F蛋白高表達可能通過抑制HCC新生血管形成而抑制HCC的侵襲轉移;SEMA3F在HCC癌組織中的表達水平可預測HCC的復發、轉移及預后。研究SEMA3F的作用方式和作用特點，對惡性腫瘤的抗血管生成治療具有積極意義。

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