甘露糖敏感型綠膿桿菌制劑對肝癌細胞增殖的影響

張建波，王莉莉，張媛媛，李文全

(1青州市人民醫院，山東青州262500;2益都中心醫院)

甘露糖高表達是腫瘤細胞的重要特征之一，目前臨床已將甘露糖作為腫瘤治療的一個重要靶點。甘露糖敏感型綠膿桿菌制劑(PA-MSHA)為一種新型免疫抑制劑，研究發現其能與甘露糖發生特異性結合并作用于腫瘤細胞［1］，對誘導肝癌細胞凋亡和抑制其轉移具有明顯優勢但其對于肝癌細胞增殖及細胞周期的影響報道較少。2013年5～12月，我們觀察了PA-MSHA對肝癌細胞增殖的影響，現分析結果并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞株HepG2、MHCC97L(復旦大學研究所所提供)。DMEM培養基(北京索萊寶科技有限公司提供)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司提供)，免疫人Cyclin D1、PCNA和CDK2以及p21與p27單克隆抗體(美國 Neomarkers公司提供)，甘露糖敏感型綠膿桿菌制劑(北京萬特爾生物制藥有限公司提供)，FACSCalibur流式細胞儀器(美國BD公司提供)、FR-200A全自動紫外裝置(上?；輧|生物科技有限公司提供)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及干預 選取肝癌細胞株 MHCC97L及HepG2分別于DMEM培養基中37℃、5%CO2條件下培養孵育，每隔3天更換1次培養基;在0.25%胰酶—乙二胺四乙酸消化后予1∶3傳代處理［2］。細胞傳代過夜、貼壁進入對數生長期后選取96孔板，每個孔板中加入100.0 μL的2 000個細胞。MHCC97L及HepG2均隨機分為對照組及觀察1組、觀察2組和觀察3組。對照組不干預，觀察1組予1.0×108/mL的PA-MSHA處理，觀察2組予2.0×108/mL的PA-MSHA處理，觀察3組予2.0×108/mL的PA-MSHA+100 mmol/L的甘露糖處理。

1.2.2 觀察項目

1.2.2.1 細胞增殖率 采取 MTT法。HepG2和MHCC97L干預后孵育培養48 h，每孔加入10.0 μL的 CCK-8 溶液;分別于干預1、2、3、4、5、6 h 測定450 nm處吸光度值，計算細胞增殖率［3］。

1.2.2.2 細胞周期 分別取培養后濃度為1.0×105/mL的HepG2和 MHCC97L細胞6.0 mL置于50.0 mL的培養瓶中，待細胞貼壁之后吸出培養液，按1.2.1分組及加藥。藥物作用72 h后消化收集細胞，離心、洗滌，調整濃度為1.0×106/mL;于-20℃環境下予70.0%乙醇行固定24 h;離心去掉固定液后PBS清洗1次，加入碘化丙啶液50.0 μL，于4℃環境下避光處理340 min。FACSCalibur流式細胞儀器檢測、分析細胞周期［4］。

1.2.2.3 細胞相關蛋白表達 HepG2和MHCC97L均先于封閉液室溫條件下封閉轉移后的PVDF膜1 h，放入雜交袋中，加入一抗稀釋，反應1 h后置入4℃冰箱處理24 h;PBST洗滌PVDF膜3次，每次15 min;加入二抗處理30 min，PBST洗滌PVDF膜4次，每次15 min;將PVDF膜置入等量混合ECL中的A、B 液中，孵育 5 min，于暗室中曝光顯影觀察［5］，測定藥物干預前后細胞細胞周期蛋白(CyclinD1)、增殖細胞核抗原(PCNA)和周期蛋白激酶2(CDK2)以及p21與p27表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件行統計學處理。計量資料采用±s表示，獨立樣本比較采取t檢驗，頻數之間比較采取χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖率 HepG2和MHCC97L的觀察1組、觀察2組細胞增殖率均明顯低于對照組(P＜0.05)，且呈劑量及時間依賴性(P ＜0.05);觀察3組與對照組比較無明顯變化。見表1、表2。

表1 MHCC97L細胞干預后不同時間細胞增殖率比較

表2 HepG2細胞干預后不同時間細胞增殖率比較

2.2 細胞周期 HepG2和MHCC97L組細胞周期變化見表3、表4。觀察1組、觀察2組細胞周期阻滯明顯強于對照組，且呈劑量及時間依賴性(P＜0.05);觀察3組與對照組比較無明顯變化，說明PA-MSHA對肝癌細胞周期有明顯的抑制作用。

表3 MHCC97L細胞周期比例(%)

表4 HepG2細胞周期比例(%)

2.3 相關蛋白表達 HepG2和MHCC97L各觀察組Cyclin D1、PCNA和CDK2表達均明顯低于對照組，p21與p27蛋白表達均明顯高于對照組(P均＜0.05)。見圖1。

3 討論

肝癌細胞惡化的過程中經常伴隨著比較復雜的細胞表面糖蛋白變化，常見的有甘露糖和唾液酸。相關研究顯示，乳腺癌、頭頸部癌及肝癌細胞均存在高含量的甘露糖，主要原因為甘露糖不能夠有效的在腫瘤細胞中轉化［6］。

圖1 各組 Cyclin D1、PCNA、CDK2及p21、p27 蛋白表達

研究發現，PA-MSHA對肝癌細胞的增殖和細胞周期均具有明顯的抑制作用［7］;而外源性甘露糖能夠阻止其抑制作用;進一步說明其細胞的毒作用主要是由甘露糖介導的;研究顯示，無論是小劑量還是大劑量PA-MSHA均對肝癌細胞的生長周期和增殖有明顯抑制作用［8］。本研究結果顯示，HepG2和MHCC97L的觀察1組及觀察2組PA-MSHA作用后細胞多數停留在G0～G1期和G2～M期，S期的增殖細胞明顯減少，且細胞增殖速率也大大降低;而觀察3組(PA-MSHA+甘露糖)細胞周期和增殖抑制并不明顯。進一步分析，不同肝癌細胞中應用甘露糖均對其具有抑制周期和增增殖的作用;本研究應用PA-MSHA的三組Cyclin D1、PCNA和CDK2表達均明顯降低，p21與p27蛋白表達均明顯升高。主要是由于Cyclin D1是肝癌細胞G1期向S期轉變的正常因子，且是G1期的常見蛋白，由于細胞周期抑制，從而使得Cyclin D1蛋白降低;PCNA和CDK2亦為G1周期中的常見蛋白，由于G1周期被抑制，促使其含量降低。p21與p27均是細胞周期的負向調節因子，由于細胞處于G0～G1期和G2～M期時其含量異常增加，從而抑制Rb蛋白的磷酸化，使得細胞周期阻滯［9］。

綜上所述，PA-MSHA對HepG2和MHCC97L增殖均具有抑制作用，其主要作用機制可能為抑制Cyclin D1、PCNA和CDK2表達，促進p21與p27表達。PA-MSHA的應用可為肝癌的治療提供新方向。

［1］李濤，湯釗猷，周建煒，等.甘露糖敏感性綠膿桿菌制劑誘導肝細胞癌凋亡的機制研究［J］.中華肝膽外科雜志，2011，17(10):838-841.

［2］呂國悅，陳儇，邱偉，等.受體作用蛋白在肝癌細胞對腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體誘導凋亡耐受中的作用［J］.中華實驗外科雜志，2011，28(10):1649-1652.

［3］Taylor PD，Wilson H，Hillier SG，et al.Effects of inhibition of vascular endothelial growth factor at time of selection on follicular angiogenesis，expansion，development and atresia in the marmoset［J］.Mol Hum Reprod，2007 ，13(10):729-736.

［4］周建煒，黃修燕，居旻杰，等.綠膿桿菌制劑對人肝癌MHCC97L細胞增殖和侵襲能力的影響［J］.中華肝膽外科雜志，2010，16(6):455-459.

［5］Yamanaka Y，Shiraki K，Inoue T，et al.COX-2inhibitors sensitize human hepatocellular carcinoma cells to TRAIL-induced apoptosis［J］.Int J Mol Med，2006 ，18(1):41-47.

［6］李濤，薛瓊，周建瑋，等.綠膿桿菌制劑抑制肝細胞肝癌生長轉移的實驗研究［J］.中華肝膽外科雜志，2009，15(11):848-850.

［7］呂國悅，張強，李航，等.腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體與肝癌細胞凋亡［J］.吉林大學學報(醫學版)，2008，34(1):167-170.

［8］Yang G，Chu W，Zhang H，et al.Isolation and identification of mannose-binding proteins and estimation of their abundance in sera fromhepatocellular carcinoma patients［J］.Proteomics，2013，13(5):878-892.

［9］郭忠義，董兆如，智緒亭，等.甘露糖敏感型綠膿桿菌制劑對肝癌細胞周期的作用機制研究［J］.中華肝膽外科雜志，2013，19(6):452-455.