野木瓜提取液中黃酮的測定及其體外抗氧化研究

崔霖蕓

（遵義醫藥高等?？茖W?；A部，貴州遵義563003）

自由基是含有一個或多個不對稱電子的原子、分子或離子，具有很強的氧化能力。生物代謝過程中會產生超氧陰離子（O2－·）和羥自由基（·OH），若其數量超過了機體的清除能力便會對機體產生損傷，如降低酶活性，促使多糖降解、DNA鏈斷裂，從而引起體內代謝紊亂，導致各種疾病發生[1]。因此，清除自由基對維持健康、延緩衰老、防癌抗癌等方面均有積極的作用。天然植物中含有豐富的抗氧化性物質如黃酮類化合物、多酚化合物、多糖化合物等。研究顯示，物質的總還原力與其抗氧化性間有顯著的正相關性，還原力的高低反映了抗氧化能力的強弱[2]，黃酮類化合物由于其分子結構中具有數量不等的酚羥基因而使其具有較強的還原性，是很好的抗氧化劑[3-4]。多酚類化合物是極好的氫或電子供體，且不會引發新的游離基或由于鏈反應而被迅速氧化，具有很好的抗氧化效果[5]。多糖中的醇羥基可以與產生·OH等自由基所必需的金屬離子絡合，抑制·OH的產生[1，6]，從而具有一定的抗氧化性。此外，皂甙類、鞣質類、褪黑素類、不飽和脂肪酸、礦物質等均有一定的抗氧化作用[5]。

野木瓜（Stauntonia chinensis）是木通科（Lardizabalaceae）野木瓜屬植物。貴州省正安縣于1996被國務院發展研究中心等單位命名為“中國野木瓜之鄉”，其盛產的野木瓜以果大、皮薄、肉細、氣香、味甘酸等特點著稱[7]。中醫典籍記載其莖葉微苦，其果味甘、平，歸心、腎經[8]，具有舒筋活絡、解渴生津、平肝和胃、祛風止痛等功效?，F代研究表明，野木瓜中含有豐富的皂苷，主要包括去甲五環三萜皂苷類化合物和木脂素苷類化合物，還含有黃酮苷類化合物、酚性成分、糖類化合物[9]，此外，野木瓜果實中含有豐富的有機酸、果膠、胡蘿卜素、黃酮類、氨基酸、多種維生素和多種礦物質等[10]，這些物質均是天然的抗氧化劑。國內外對野木瓜的鎮痛抗炎、放射增敏及肝保護等方面的研究較多[11-12]，但對野木瓜提取物的抗氧化能力的研究卻很少。顯然，在人們日益關注自身保健的今天，若能發現野木瓜的抗氧化功效，分析其抗氧化能力的主要成分，將對開發其在保健、防癌抗癌方面的新用途具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

野木瓜：購自貴州正安縣的新鮮野木瓜果。試劑：蘆?。˙R，國藥集團化學試劑有限公司）石油醚、水楊酸、無水乙醇、VC、HCl、H2O2均為化學純，鐵氫化鉀、鄰苯三酚、三氯乙酸、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、FeCl3均為分析純，pH=6.6的K2HPO4－KH2PO4緩沖溶液（配置方法見文獻[13]p331）、pH=8.34 的 Na2HPO4－KH2PO4緩沖溶液（配置方法見文獻[14]p298）。

1.1.2 儀器

BSA223型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；752N紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；PHS-2F型精密酸度計：上海雷磁儀器廠；RE-52A型旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-DⅢ型予華牌循環水真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；TL80-2型離心機：姜堰市天力醫療器械有限公司；DK-S26型恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 野木瓜提取液的制備

野木瓜鮮果洗凈去籽囊切成2 mm～5 mm薄片→于50℃烘干至恒重→粉碎，過40目篩→40℃石油醚回流脫色→抽濾，濾渣風干得野木瓜粉。

1）醇提物：稱取野木瓜粉5.000 g，置入250 mL圓底燒瓶中，加入83%的乙醇151 mL，70℃回流浸提2 h，抽濾，濾液在60℃減壓濃縮，定容至25 mL，得野木瓜醇提物。

2）水提物：用蒸餾水取代1）中的乙醇溶液，重復1）的操作，得野木瓜水提物。

1.2.2 蘆丁標準曲線的繪制

準確稱量25 mg干燥（100℃）至恒重的蘆丁置于50mL溶量瓶中，用95%乙醇定容，配制制成0.5 mg/mL蘆丁標準液。用移液管分別取該標準液 0、1、2、3、4、6、8 mL置于50 mL容量瓶中，相應加入30%乙醇20、19、18、17、16、14、12 mL 搖勻配成不同濃度蘆丁溶液，再分別加入5%NaNO21 mL搖勻放置6 min，再加入10%Al（NO3）31mL搖勻放置6 min，然后加入4%NaOH 7 mL，用30%乙醇定容，搖勻放置11 min，在D510 nm處測定吸光度值，得標準曲線：

C=0.014+9.817A

式中：C為濃度，0.01 mg/mL；A為吸光度判定系數，R2=0.999。

1.2.3 黃酮含量的測定

分別取醇提物、水提物5 mL置于50 mL容量瓶中，用30%乙醇定容后搖勻（即將原溶稀釋10倍），取該稀釋液5 mL置于50 mL容量瓶中，按1.2.2的方法加入各試劑后定容（此處測試液總體積為50 mL，相當于將稀釋液再稀釋10倍），在D510nm處測得吸光度值A，由標準曲線可求得測試液中黃酮濃度為C×0.01（mg/mL），據此可計算出提取液的黃酮濃度為C提＝C×0.01×10×10＝C（mg/mL），提取液中黃酮含量為x=C×25。

1.2.4 總還原力測定[1，15-16]

采用Oyaizu法，其原理是通過待測液將Fe3+還原為Fe2+的多少來檢測其還原力。分別取醇提物、水提物0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL（并相應加入蒸餾水4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.0、0.0 mL 以使各溶液體積相等）及濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mg/mL 的 VC4.0 mL，依次加入pH=6.6的K2HPO4－KH2PO4緩沖溶液5.0 mL，質量分數1%的鐵氫化鉀3.0 mL，于50℃恒溫水浴反應20 min后急速冷卻，加入質量分數10%的三氯乙酸3.0 mL，迅速搖勻后在 3000 r/min離心10 min，取上清液2.5mL，加入蒸餾水2.0mL，質量分數0.1%的FeCl30.5 mL，搖勻靜置10 min，在D700 nm處測吸光度值。

1.2.5 羥基自由基（·OH）清除率的測定[16-18]

應用Fenton法，基本原理為：過氧化氫在過渡金屬離子催化作用下發生均裂產生羥自由基（·OH）：[13]

H2O2+Fe3+→·OH+H2O+Fe3+

基于水楊酸能捕獲·OH并生成有色物質，在510nm處有最大吸收，因此可通過測定吸光度來測定·OH的多少。但加入具有清除·OH功能的待測液后，待測液與水揚酸競爭·OH，會減少有色物質的生成，據此可測定待測液對·OH的清除力。

在19支25 mL具塞比色管中依次加入2 mmol/L的FeSO4的 3.0 mL和6 mmol/L的水揚酸 3.0 mL，搖勻，再分別加入醇提物、水提物 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL，并相應加入蒸餾水 4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.0、0.0mL以使各溶液體積相等，在另一組中分別加入濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL、0.6、0.8 mg/mL 的 VC4.0 mL，再分別向各比色管中加入2 mmol/L的H2O23.0 mL，搖勻，37℃恒溫水浴反應15 min，取出在D510 nm處測得吸光度值A，據此計算待測液對·OH的清除率：

清除率 =（A0-Ax）/A0× 100%

式中：A0為空白管（即加入4.0 mL蒸餾水）的吸光度值；Ax為加入各待測液后的吸光度值。

1.2.6 超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測定[16，19-20]

采用鄰苯三酚自氧化法，取pH=8.34的Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液4.7 mL，加入4.0 mL蒸餾水，搖勻，再加入3 mmol/L的鄰苯三酚0.3 mL（用10 mmol/L的HCl配制，空白管用10 mmol/L的HCl代替），迅速搖勻倒入比色皿中，在D325 nm處測吸光度值，每隔30秒記錄一次，至4.5 min，將吸光度值與時間回歸，其斜率即為鄰苯三酚自氧化速率。

待測液清除O2-·的測定：用待測液代替蒸餾水，即不加蒸餾水，而是分別加入醇提物、水提物0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0，并相應加入蒸餾水 3.5、3.0、2.5、2.0、1.0、0.0mL使反應體系總體積保持9.0 mL。對照組則加入濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mg/mL 的 VC4.0 mL，重復上述實驗。超氧陰離子自由基清除率為：

抑制率 =（V0-Vx）/V0× 100%

式中：V0為未加待測液（即加入4.0 mL蒸餾水）的鄰苯三酚自氧化速率；Vx為加入待測液后的鄰苯三酚自氧化速率。

2 結果與分析

2.1 總黃酮含量的測定

實驗結果測得野木瓜醇提物和水提物的吸光度值分別為0.674和0.416，由1.2.2和1.2.3的方法可計算出醇提物中黃酮濃度為6.63 mg/mL，水提物中黃酮濃度為4.10 mg/mL，醇提物的黃酮濃度高于水提物。

2.2 總還原力的測定

圖1 野木瓜提取液的還原力Fig.1 The reduction energy of the extraction from Stauntonia Chinensis

實驗結果見圖1，各待測液的總還原力變化趨勢相似，即隨著加入野木瓜提取液量（或VC濃度）的增加，吸光度值開始迅速增加（即待測液的總還原力迅速增加），但當提取液的量增加到1.5 mL（或VC濃度增加到0.3 mg/mL）后，增長趨于平緩。吸光度值的大小反應了總還原力的強弱，因此，總還原力由強到弱依次為VC＞野木瓜醇提物＞野木瓜水提物，這主要可能是因為醇提物中的黃酮濃度高于水提物，說明野木瓜的總還原力主要來自于其中的總黃酮。當加入野木瓜醇提物4 mL時（相當于從0.8 g野木瓜干粉中提取的液量，換算過程為 5 g/25 mL×4 mL=0.8 g，參見 1.2.1），其還原力只是略低于0.8 mg/mL的VC的還原力，說明野木瓜提取物有較強的還原力?？傔€原力與抗氧化性間有顯著正相關，還原力的高低反映了抗氧化能力的強弱[21]。因此說明野木瓜提取液有較強的抗氧化能力，且醇提物優于水提物。

2.3 對羥基自由基（·OH）的清除作用

圖2是描述了野木瓜提取液對·OH的清除作用。

圖2 野木瓜提取液對·OH的清除Fig.2 The·OH scavenging effects of the Stauntonia Chinensis extraction

野木瓜醇提物和水提物的變化趨勢相似，隨著添加提取液量的增加，清除率迅速上升，在添加量超過1.5 mL后增加速度放慢，并在超過3.0 mL后趨于平緩。VC對·OH的清除作用在濃度較低時，作用較小，低于野木瓜提取液，但隨著濃度的上升，其清除作用上升得最快，并迅速超過野木瓜提取液的清除能力。從清除作用大小看，醇提物和水提物對·OH的清除作用基本相當，且與VC的差別不明顯。原因可能是盡管醇提物中的黃酮含量高于水提物，使醇提物對·OH有較好的清除作用，但據王文平等的測定，正安野木瓜中多糖（通過蒸餾水浸提）的含量高達12.02%[22]，而多糖易溶于水，難溶于醇，因此水提物中溶有較多的多糖，多糖類化合物對·OH有較好的清除作用[1，6]，從而增加了水提物對·OH的清除率，使兩者作用大致相當。當加入4 mL野木瓜提取液（相當于從0.8 g野木瓜干粉中提取的液量），對·OH的清除率可達到77.42%（水提物）和76.66%（醇提物），與0.246 mg/mL的VC的清除率79.26%幾乎相當（即加入4 mL的0.8 mg/mL的VC的清除率，此處換算為：總反應液量為13 mL（見1.2.3），因此，反應液中 VC的濃度為 0.8 mg/mL×4 mL/13 mL=0.246 mg/mL），說明野木瓜提取液對·OH有很好的清除作用。

2.4 對超氧陰離子（O2－·）的清除作用

圖3 野木瓜提取液對O2－·清除Fig.3 The O2－·scavenging effects of the Stauntonia Chinensis extraction

圖3給出了野木瓜提取液對超氧陰離子（O2－·）的清除作用，野木瓜乙醇提取液對O2－·的清除作用和VC作用趨勢和大小都極為相似，隨著醇提物添加量的增加（VC濃度的增加），清除率迅速增加，并在超過2 mL（VC濃度0.4 mg/mL）后趨于平穩。水提物隨著添加量的增加，清除率一直增加，在超過3 mL后趨于平緩，但其清除作用明顯低于醇提物，其原因很可能是醇提物中黃酮類化合物含量高于水提物的原故，盡管水提物中多糖含量較高也未能彌補這個差異，說明野木瓜對O2－·的清除能力主要來自于其中的黃酮類化合物。當加入4 mL提取液量（相當于從0.8 g野木瓜干粉中提取的液量），對O2－·的清除率可達到96.36%（乙醇提?。?，與0.356 mg/mL的VC的清除率96.69%相當（此處即為加入4 mL 0.8 mg/mL的VC時的清除率，換算過程是：總反應液量為9 mL（見1.2.4），因此，反應液中VC的濃度為 0.8 mg/mL×4 mL/9 mL=0.356 mg/mL），說明野木瓜醇提物對O2－·有很好的清除作用，野木瓜水提物對O2－·的清除作用盡管比醇提物小，但也達到90.78%，說明水提物對O2－·也有較好的清除作用。

3 結論

實驗證實野木瓜乙醇提取液在總還原力和對超氧陰離子（O2－·）的清除率上均明顯高于水提物，但在清除羥基自由基（·OH）能力上，醇提物與水提物作用大致相等，其主要原因可能是由于醇提物中總黃酮含量高于水提物，盡管水提物中溶有更多多糖，也不能彌補水提物與醇提物在總還原力和對O2－·的清除率上的差距，但由于多糖類化合物對羥自由基有較好的清除作用[1，6]，使二者在·OH清除率上大致相等。這說明野要瓜的抗氧化作用主要來自于野木瓜中的黃酮類化合物，其多糖類化合物也有一定的作用。與VC相比，野木瓜醇提物在總還原力上略低于VC，但在對超氧陰離子（O2－·）和羥基自由基（·OH）的清除率上大致相當，說明野木瓜有很好的抗氧化作用，是一種較好的天然抗氧化劑，對維持健康、延緩衰老、防癌抗癌等方面均有積極的作用，對推廣和開發野木瓜飲品、食品、保健藥品等具有一定的指導作用。

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