1株具有抑制乙酰膽堿酯酶活性的牡蠣共生真菌的鑒定及發酵條件的優化*

王鳳舞，孟麗媛

(青島農業大學食品科學與工程學院，山東青島，266109)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種常見的老年性腦神經退行性病變，發病率較高，已成為現代社會嚴重威脅老年人生命的疾病之一［1］。關于AD病理較為接受的為“膽堿能缺失學說”，認為大腦內神經遞質——乙酰膽堿的缺失是導致 AD的關鍵原因［2-3］，目前AD的治療臨床上主要是采用乙酰膽堿酯酶抑制劑，如他克林、加蘭他敏、石杉堿甲等，這些藥物可以提高患者體內的乙酰膽堿的水平，具有一定的療效，但是化學藥物副作用比較明顯，不利于患者長期服用。

目前如何從天然產物中尋找并開發抗AD藥物成為研究人員關注的新焦點［4］。其中特境微生物——共(內)生菌作為新的藥物來源已經顯示出巨大的開發潛力。共(內)生菌是指寄生于宿主體內并且不引起宿主致病癥狀的一類微生物，在與宿主長期共進化的過程中進行了“基因重組”，因而能產生豐富的活性次生代謝產物［5］。

牡蠣，又名蠔，營養豐富，含有大量的蛋白質、維生素、?；撬岬葼I養成分及多種功能活性成分，具有很好的強肝解毒、抗癌、滋容養顏，延緩衰老的功效，長期食用可以預防老年癡呆［6］?；趦裙采碚?，牡蠣共生菌產生抗老年癡呆活性成分的可能性極大。在前期的試驗中，本課題組已從牡蠣中分離篩選獲得1株共生真菌WFW mL4，其液態發酵產物具有較好的抑制乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性。本論文擬對該菌株進行菌種的鑒定，并對其進行發酵條件的優化，促進有益成分大量產生，為天然抗老年癡呆先導化合物的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株:牡蠣(青島海域)中分離得到的共生真菌WFW mL4。

斜面培養基:葡萄糖2%，馬鈴薯20%，瓊脂2.0%，海水加熱溶解。

種子液培養基:2.0%蔗糖，馬鈴薯浸汁加熱溶解，分裝滅菌。

察氏培養基:3.0% 蔗糖，0.3%NaNO3，0.05%KCl，0.05%MgSO4·7H2O，0.001%FeSO4，0.01%K2HPO4，0.1% 酵母膏，海水加熱溶解。

PD培養基:2.0%葡萄糖，馬鈴薯浸汁加熱溶解，分裝滅菌。

PS培養基:2.0%蔗糖，馬鈴薯浸汁加熱溶解，分裝滅菌。

SP 培養基:蔗糖2.0 g，KH2PO40.3g，MgSO4·7H2O 0.15 g，VB11 mg，馬鈴薯浸汁100 mL 加熱溶解，分裝滅菌。

SP’培養基:蔗糖 2.0 g，KH2PO40.3g，MgSO4·7H2O 0.15 g，VB11 mg，pH 6.0，馬鈴薯蒸餾水浸汁 100 mL加熱溶解，分裝滅菌。

試劑:十二烷基磺酸鈉SDS，乙酰膽堿酯酶，乙酰膽堿碘代物AchI，3，5-二硫二硝基苯甲酸DTNB，他克林，sigma;乙酸乙酯，天津富宇精細化工;SK8229真菌基因組DNA快速抽提試劑盒，上海生工生物工程有限公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒;Omega公司。

1.2 儀器與設備

全自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋YXQ-LS-SⅡ，上海博訊實業有限公司;恒溫振蕩器IS-RDH1，蘇州麥可旺志生物技術有限公司;DHP-9032電熱恒溫培養箱，中國龍口市先科儀器有限公司;IS-RDV3立式恒溫振蕩器，美國精騏有限公司;RE-52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠;冷凍干燥機FD-1D-80，北京博醫康實驗儀器有限公司;DU-800紫外/可見分光光度計，美國貝克曼公司;PCR反應擴增儀，加拿大BBI公司;3730測序列分析儀，美國 ABI公司;TGL-16M型高速臺式冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;超凈工作臺SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術有限公司;電子分析天平，美國奧豪斯電子天平公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 WFW mL4 菌株鑒定

1.3.1.1 WFW mL4 菌株形態鑒定

將保藏的菌種于PDA平板中培養，觀察菌落形態特征及子囊孢子特征。菌落特征主要包括菌落的形狀、大小、顏色、表面狀況、質地、光澤等。在顯微鏡下觀察菌絲體的形態及子囊果和子囊孢子的形態等［7-9］。

1.3.1.2 WFW mL4 菌株分子生物學鑒定

菌株分子生物學鑒定通過測定該真菌的18S rDNA序列進行種屬鑒定［10］。

(1)基因組提取及電泳檢測

①基因組提取:按照生工SK1375真菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取。

②PCR反應:

引物序列:

NS15’ GTAGTCATATGCTTGTCTC 3’

NS65’ GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC 3’

PCR擴增程序:

模版，1 μL;引物 NS1，NS6，各 1 μL;Taq 酶，1 μL;Buffer，5 μL;dNTP，4 μL;無菌水，37 μL;共計50 μL。

③PCR產物電泳:1.2%瓊脂糖電泳檢測。

(2)DNA瓊脂糖切膠回收純化:采用Omega回收試劑盒。

(3)目的片段TA連接

在微量離心管中加入 1 μL PEASY-T1溶液，4 μL DNA溶液。30℃反應5 min。取出Top10感受態細胞在冰上融化。將反應液加入到感受態細胞中。冰浴30 min。42℃熱激30 s，冰浴3 min以上。加入滅菌的LB液體培養基300 μL，在37℃搖床200 r/min，40 min。取出離心管，8 000 r/min離心數秒，吸取200 μL，上清液棄掉。余下的重懸涂 LB平板(Amp)。選用藍白斑篩選，37℃恒溫過夜培養。次日挑取白色單菌落在加Amp的液體LB培養基搖床7h，送測序公司測序。

(4)DNA測序

由上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

(5)系統進化樹的構建及分析

將測定的該菌株的18S rDNA基因序列通過BLAST軟件將該序列與基因庫中相關序列進行比對并進行同源性比較，進而確定菌株的分類。利用MEGA4.0軟件中的鄰接法(neighbour-joining method，NJ)［11］，將相關性最高的菌株同 WFW mL4 菌株一同構建系統進化樹。

1.3.2 菌株WFW mL4液體發酵條件的優化

1.3.2.1 不同培養基對菌株WFW mL4次生代謝產物AChE抑制率的影響

分別選取察氏培養基、PD培養基、PS培養基、SP培養基、SP’培養基作為該菌發酵培養基，固定接種量10%，500 mL三角瓶裝液量150 mL，在28℃發酵10 d。所得發酵液經乙酸乙酯萃取后，配制成5 mg/mL濃度，測定其AChE抑制率。選取最適合該菌的發酵培養基，每種處理3個重復。

1.3.2.2 裝液量對菌株 WFW mL4次生代謝產物AChE抑制率的影響

固定其他條件不變，500 mL三角瓶裝液量分別為 50、100、150、200 和250 mL，測定 5 mg/mL 發酵液提取物抑制AChE活性，選擇最適發酵裝液量。每種處理3個重復。

1.3.2.3 發酵溫度對菌株WFW mL4次生代謝產物AChE抑制率的影響

以SP培養基為發酵培養基，培養溫度分別選取19、22、25、28 和31 ℃，固定其他條件不變，測定代謝產物的AChE抑制率。選取最適合該菌的發酵溫度，每種處理3個重復。

1.3.2.4 發酵時間對菌株WFW mL4次生代謝產物AChE抑制率的影響

固定其他條件不變，發酵時間分別為6、8、10、12和14 d。制備發酵液乙酸乙酯相浸膏，配制成5 mg/mL濃度，測定其 AChE抑制率。選取適合該菌產生AChE抑制物的最佳發酵條件。每種處理3個重復。

1.3.2.5 培養基初始pH值對菌株WFW mL4次生代謝產物AChE抑制率的影響

固定其他條件不變，將培養基的初始pH分別調到 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，測定 5 mg/mL 發酵液提取物抑制AChE活性，選取最適合該菌產生AChE抑制物的發酵培養基pH。每種處理3個重復。

1.3.2.6 接種量對菌株 WFW mL4次生代謝產物AChE抑制率的影響

固定其他條件不變，接種量分別為1%、5%、10%、15%和20%，測定5 mg/mL發酵液提取物抑制AChE活性，選取最適接種量。每種處理3個重復。

1.3.2.7 光照時間對菌株WFW mL4次生代謝產物AChE抑制率的影響

固定其他條件不變，接種后先避光，后見光培養，見光培養時間分別選取 0、2、4、6、8 d，總發酵時間為10 d。測定5 mg/mL發酵液提取物抑制AChE活性，選取最適的光照時間。每種處理3個重復。

1.3.3 乙酰膽堿酯酶抑制活性的測定

抑制AChE活性測定參照改良Ellman法［12］。取4支10 mL的試管(1～4)分別標注為空白、對照、樣品、本底放于37℃的恒溫水浴中，向這4支試管中分別添加 pH=8.0 磷酸緩沖液(2 950 μL、2 880 μL、2 880 μL、2 950 μL)、乙酰膽堿碘代物20 μL、顯色劑DTNB 100 μL;然后向1、2號試管中各加入 DMSO 100 μL，3、4 號試管中各加入待測樣品溶液 100 μL，2、3號試管中再各加入70 μL的乙酰膽堿酯酶后混勻、在水浴中反應4 min 20 s后再向各試管中分別添加40%的SDS終止劑100 μL終止反應;最后在412 nm下測其OD值，通過計算公式計算出樣品對乙酰膽堿酯酶的抑制率［13］:

2 結果與分析

2.1 菌株WFW mL4鑒定結果

2.1.1 菌株WFW mL4形態學特征

菌株WFW mL4的形態學特征如圖1所示。該菌為絲狀真菌，在PDA培養基平板上快速生長，形成白色疏松絨毛狀菌落。菌絲為白色，有分枝和橫隔。當該菌接種到PDA培養基上7 d后，在菌落中心逐漸出現黃色顆粒，該黃色顆粒為未成熟的子囊果;10 d后，子囊果成熟變成黑色。子囊果的外周被橄欖色或者黃綠色的附屬絲包圍著。子囊孢子是淺棕色，檸檬狀。菌株WFW mL4的形態學特征和文獻中報道的球毛殼菌的形態學特征相符合［8］。

圖1 菌株WFW mL4的形態學特征Fig.1 Morphological features of strain WFW mL4

2.1.2 WFW mL4菌株分子生物學鑒定

圖2 PCR產物電泳圖譜Fig.2 The electrophoretogram of PCR product

圖2為菌株WFW mL4的18S rDNA的PCR產物電泳圖，可以看出，菌株WFW mL4的18S rDNA片段長度在1 000～2 000 bp之間。菌株WFW mL4的18S rDNA序列長度為1 691bp，與電泳結果一致。該核酸序列已被加載到 GenBank中，登陸號為JQ964323。利用BLAST軟件將該序列與美國生物信息中心(NCBI)進行比對分析，結果表明:菌株WFW mL4的18S rDNA與球毛殼菌的相似度高達99%，參考菌株的 GenBank登錄號 DQ234257，AY545725，JQ686920，JN639019 和 AB048285，同 時，利 用MEGA4.0軟件構建該菌株的系統發育樹(圖3)。

通過菌株WFW mL4的形態學特征和18S rDNA序列，可以確定該菌株為球毛殼菌(Chaetomium globosum)。該菌種已被保存到中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌種編號為CGMCC NO.6571。

2.2 菌株C.globosum WFW mL4液體發酵條件的優化

2.2.1 不同培養基對菌株 C.globosum WFW mL4發酵液提取物AChE抑制率的影響

圖3 菌株WFW mL4的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain WFW mL4

本實驗研究了5種發酵培養基對菌株C.globosum WFW mL4次生代謝物AChE抑制率的影響。如圖4所示，柱狀圖上不同字母表示差異顯著，由此可以看出:5種培養基對于該菌發酵液粗浸膏的AChE抑制率影響顯著(P＜0.05)。采用SP培養基發酵獲得的粗浸膏對 AChE抑制率最大，為(47.19±0.76%)%。SP培養基是最適合該菌液體發酵的培養基。SP與SP’培養基的區別是前者采用海水配制，后者采用蒸餾水配制。從圖中可以看出，用SP培養基發酵獲得的粗浸膏的AChE抑制率明顯高于SP’，這說明了海水環境對于C.globosum WFW mL4發酵產生抑制AChE活性的次生代謝產物是必需的。這可能是由于海水造成的高鹽、高壓環境對海洋真菌C.globosum WFW mL4次生代謝途徑的影響，從而影響其次生代謝產物的產生［14］。

2.2.2 裝液量對菌株 C.globosum WFW mL4次生代謝產物的影響

裝液量是間接評價溶氧量對發酵代謝影響的指標。由圖5可以看出，隨著裝液量的增加，發酵液提取物對AChE的抑制率呈現先增大后減小的趨勢。當500 mL三角瓶裝液量為200 mL時，發酵液提取物對AChE的抑制率達到最大值，為(68.07±3.23)%，這說明C.globosum WFW mL4菌株在液體發酵的過程中是需要氧氣的。因此，確定C.globosum WFW mL4菌株液體發酵500 mL三角瓶的最佳裝液量為200 mL。

2.2.3 發酵溫度對菌株 C.globosum WFW mL4次生代謝產物的影響

圖4 不同培養基對粗浸膏的AChE抑制率的影響Fig.4 Effect of medium on the AChE inhibition rate of crude residue

圖5 裝液量對發酵液提取物AChE抑制率的影響Fig.5 Effect of culture volume on inhibition ratio of AChE

圖6 發酵溫度對粗浸膏質量和AChE抑制率的影響Fig.6 Impact of fermentation temperature on the AChE inhibition rate and weight of crude residue

由圖6可以看出，溫度對發酵液粗浸膏AChE抑制率的影響較小，說明菌株C.globosum WFW mL4的適應溫度范圍較寬。菌株的適應發酵溫度可能與其宿主有關，有研究表明牡蠣生長的最佳水溫為22℃，其攝食和代謝的水溫在18～28℃處于較適宜水平［15］。當發酵溫度低于22℃時，隨著發酵溫度的升高，該菌株發酵液粗浸膏的質量以及其對AChE的抑制率均隨之增大，當達到22～28℃時，發酵液粗浸膏質量變化趨勢不明顯，在25℃時達到最大值，其粗浸膏質量為(166.25 ± 8.71)mg，AChE 抑制率為(65.69 ±1.69)%。當發酵溫度繼續升高時，發酵液粗浸膏質量及其AChE抑制率均下降，說明溫度過高會抑制菌株AChE活性代謝產物的合成和分泌。因此，確定該菌株液體發酵的最佳溫度為25℃。

2.2.4 發酵時間對菌株 C.globosum WFW mL4次生代謝產物的影響

圖7 發酵時間對粗浸膏質量和AChE抑制率的影響Fig.7 Effect of fermentation time on the AChE inhibition rate and weight of crude residue

在真菌液體發酵過程中，其次級活性代謝產物的產生時間有所不同。由圖7可以看出，在發酵初期，隨著發酵時間的延長，發酵液粗浸膏質量及其對AChE活性抑制率逐漸升高，到第10天時，發酵液粗浸膏質量達到最大值(154.7 ± 19.8)mg，此時其AChE抑制率為(67.43±1.30)%。當發酵時間繼續延長時，發酵液粗浸膏質量開始下降，其對AChE抑制率增長不明顯。這是因為在發酵初期菌絲體初級代謝為主，次生代謝為輔，進行大量生長增殖，產生的少量次生代謝產物并未及時排出細胞外;到發酵中后期以次級代謝為主，開始產生大量次生代謝產物并排出細胞外;到發酵后期，培養基的營養物質已被消耗盡，部分菌絲體自溶，培養基粘度增大影響氧氣傳遞速率，影響次生代謝產物的產生或者影響次生代謝途徑［16］。因此，確定 C.globosum WFW mL4菌株最佳液體發酵時間為10 d。

2.2.5 培養基初始 pH對菌株 C.globosum WFW mL4次生代謝產物的影響

培養基的初始pH值對菌株的生長和代謝有直接影響，初始pH值應使菌株快速生長并且有利于代謝產物的產生［16］。在圖8中，發酵液粗浸膏質量和AChE抑制率的變化趨勢較明顯，表明發酵液的初始pH對C.globosum WFW mL4菌株產抑制AChE活性代謝物的影響顯著。該菌在pH=6.0時發酵液粗浸膏質量以及其對AChE抑制率達到最大值，即粗浸膏質量為(165.55 ± 8.15)mg，AChE 抑制率為(65.61±0.98)%。原因可能是該菌的生長環境pH對該菌的次生代謝產物產生具有激發作用。因此該菌的最適發酵培養基的pH為6.0。

圖8 pH值對粗浸膏質量和AChE抑制率的影響Fig.8 Effect of incubation pH value on the AChE inhibition rate and weight of crude residue

2.2.6 接種量對菌株 C.globosum WFW mL4次生代謝產物的影響

接種量的多少可影響液體發酵過程中菌絲體的生長速度及其代謝產物的產量。由圖9可以看出，接種量從1%到10%，隨著接種量的增加，該菌株發酵液粗浸膏質量及其AChE抑制率均隨之增強，當接種量達到10%時，發酵液粗浸膏質量及其AChE抑制率達到最大值，分別為(158.15 ±8.71)mg，(68.45 ±1.03)%。接種量繼續增大時，發酵液粗浸膏質量及其對AChE的抑制率均出現下降趨勢。原因可能為接種量過大，引入的抑制次生代謝的有害物質相應增多，對產物的合成不利，或者菌絲體在發酵前期生長過于旺盛，空間和資源相對匱乏，培養基中的營養成分被大量消耗，進而影響發酵后期代謝產物的形成和分泌［16］。因此，確定 C.globosum WFW mL4菌株液體發酵的最佳接種量為10%。

圖9 接種量對粗浸膏質量和AChE抑制率的影響Fig.9 Effect of inoculum concentration on the AChE inhibition rate and weight of crude residue

2.2.7 光照時間對菌株 C.globosum WFW mL4次生代謝產物的影響

圖10 光照時間對粗浸膏質量和AChE抑制率的影響Fig.1 0 Effect of light period on the AChE inhibition rate and weight of crude residue

由圖10可知，隨著光照時間的變化，發酵液粗浸膏質量和AChE抑制率并未呈現規律性趨勢，說明光照時間對C.globosum WFW mL4菌株發酵液粗浸膏質量和AChE抑制率幾乎無影響或者影響不大。

3 結論

(1)經形態學及分子生物學鑒定，可確定WFW mL4菌為球毛殼菌，命名為 Chaetomium globosum WFW mL4。

(2)從發酵優化實驗結果可以看出:該菌最適發酵培養基為SP培養基，并且該菌株只在海水環境下代謝產生AChE抑制物;培養基的初始pH對該菌株產AChE代謝產物的影響顯著，其最適培養基pH為6.0;發酵的最佳接種量為10%，500 mL三角瓶的最佳裝液量為200 mL，最適的發酵溫度和時間分別為25℃和10 d，光照時間對該菌株發酵幾乎無影響。

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