熱處理對乳中重要生物活性成分影響的研究進展*

李延華，孟岳成，陳杰

(浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州，310018)

乳是哺乳動物分泌的提供給后代的營養源，其中包含乳蛋白質、乳脂肪、乳糖、維生素和礦物質等營養成分，同時乳中也存在一系列生物活性物質。乳中生物活性物質包括:源自乳蛋白水解的生物活性肽，存在形式是蛋白質某一區域呈現的，通過蛋白水解消化而釋放并激活的生物活性肽;乳清中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白、過氧化物酶、溶菌酶;乳脂肪中的乳脂肪球膜蛋白、共軛亞油酸;生長因子、激素和細胞活素類［1］。

近年來，有關牛乳中生物活性成分的種類及功能研究較為全面，已明確了不同生物活性成分的具體生物功能。然而，乳制品在加工過程中不可避免的會對乳體系中功能性成分的活性、結構產生影響。熱處理是不同乳制品生產過程中不可或缺的工藝手段，盡管已有研究表明，添加保護劑可以減少某些生物活性成分在熱處理過程中的熱失活現象，但加熱一定會導致生物活性成分發生活性降低、變性或者激活，進而影響乳制品中功能性活性成分的生理作用，評估熱處理對乳中生物活性成分的影響具有重要的現實意義。

1 熱處理過程中乳鐵蛋白的生物活性和分子結構的變化

1.1 乳鐵蛋白的含量與生理功能

乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)是鐵與糖蛋白結合的產物，常乳中LF含量范圍為0.004～0.271 mg/mL，平均為0.101 mg/mL［2］，當 LF 失去鐵使鐵飽和度在5%以下時，為缺鐵型乳鐵蛋白(apo-lactoferrin，apo-LF)，而當LF結合鐵使鐵飽和度大于85%，為鐵飽和乳鐵蛋白(holo-lactoferrin，holo-LF)［3］。研究表明 LF具有抗菌、抗病毒、免疫調節、促進鐵吸收、促進骨重建和抑制破骨細胞介導的骨吸收等功能［4-5］。

1.2 乳鐵蛋白生物活性的熱穩定性

大量研究表明，LF的熱穩定性與pH緊密相關。Ruegg等發現，牛乳LF在pH6.6，65～69℃時開始失活［6］。Abe等研究發現，牛乳apo-LF在酸性條件下比較穩定，pH 4.0酸性條件下，采用90℃加熱5 min后LF的抗原活性、鐵結合力、抑菌活性幾乎無變化;采用70℃預熱3 min，然后進行UHT殺菌(130℃、2 s)發現鐵結合能力僅損失3%，LF在酸性條件下較耐熱，在中性和堿性條件下會發生渾濁和凝膠化［7］。然而，Sreedhara等指出，在 pH 2.0～8.0內，牛乳 LF變性是不可逆的，并且變性溫度隨著pH減小而降低，同時指出由于pH 2.0條件下LF具有最大的疏水性，使其在(25±1)℃時發生變性，并且此時變性溫度并不容易準確測定，所以認為牛乳LF的變性溫度在 pH 3.0 下降到最低［8］。

基于不同加熱強度LF活性的變化，Paulsson等發現，巴氏殺菌(72℃、15 s)對apo-LF和holo-LF的抗菌活性沒影響，但UHT(135℃、4 s)處理后holo-LF不能結合到細菌上，并且apo-LF也失去抑菌活性［9］。Oria等研究發現，137℃、8 s處理后LF對單核細胞的增殖作用幾乎沒影響［10］。Dupont等檢測發現，與原料乳相比較，巴氏殺菌對乳中LF并無顯著影響，經過120～139℃、4 s處理后，LF的活性基本完全喪失，變性率為 95.38%［11］。

1.3 熱處理誘導乳鐵蛋白的結構表征

Sanchez等對牛乳LF在72℃到85℃變性一級反應動力學發現，apo-LF比holo-LF更易變性，分析原因可能是因為鐵離子的結合促使LF二硫化物結合，從而防止了蛋白聚合［12］。Indyk等采用免疫分析方法，通過多表位決定因素分析加熱后蛋白質變性導致完整構象損失，發現將原料乳和水溶液中的LF(pH 6.8)經過70℃、2 min的熱處理后，85%的 LF保持完整的抗原特性，證實典型的巴氏殺菌所造成的LF的熱暴露，能夠保留構象的完整性，較高溫度和時間的加熱強度使LF的完整構象發生顯著損失，研究中通過熱誘導的動力學參數確定牛乳LF變性的第一階段為蛋白質構象的展開，同時LF的變性受到鐵結合狀態的影響，而且apo-LF和holo-LF構象的展開是相互獨立的，提出蛋白質發生部分的變性會導致其構象受到干擾，結果是仍保留其活性功能或者導致聚集、沉淀和功能喪失［13］。

Guillaume等描述了LF的熱聚合機制，如圖1所示，提出在早期階段，加熱后LF形成非共價鍵結合的可溶性低聚體，然后這些低聚物通過二硫鍵或者非共價鍵的分子間聚集形成較大的不溶性聚合物。聚合物形成的程度取決于LF的鐵飽和度，apo-LF對熱較敏感，接近60℃加熱時開始發生變性，暴露非共價鍵的位點，通過非共價鍵和二硫鍵反應并形成非共價鍵聚合體。Holo-LF中結合的鐵可以穩定蛋白質結構，當溫度達到80℃時二硫鍵發生反應，通過分子間二硫鍵交聯形成可溶性的聚合體［14］。

圖1 缺鐵型乳鐵蛋白(A)和鐵飽和乳鐵蛋白(B)的熱聚合機制Fig.1 General mechanism proposed for the thermal aggregation of native apo-lactoferrin(apo-Lf)(A)and holo-Lf(B)

2 乳過氧化物酶體系生物活性的熱穩定性

乳過氧化物酶體系(lactoperoxidase systems，LPS)是一種牛乳中天然的抑菌系統，含有乳過氧化物酶(Lactopcroxidase，LPO)，硫氰酸根(SCN-)和H2O2。在H2O2存在的條件下，LPO催化SCN-，使其氧化成亞硫氰酸(HOSCN)，HOSCN會分離，中間產物OSCN-的主要抗菌機制是氧化包括酶在內的蛋白質分子巰基(SH)，使之成為硫(氧)基衍生物，并進一步水解產生次磺酸。

LPO在牛乳酶系中熱穩定性最大，LPO活力的殘留可以用來檢驗牛乳巴氏殺菌的效果。Korhonen報道，LPO在低溫巴氏殺菌(63℃、30 min或72℃、15 s)后仍有活力，但是經 80 ℃、2.5 s處理后失活［15］。另外，De Wit等報道 LPO完全失活需要78℃、15 s［16］。Marks等發現常規巴氏殺菌不能使牛乳中LPO失活，72℃、15 s巴氏殺菌后，接種銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、嗜熱鏈球菌，激活LPS后可以增強原料乳的保存性，但是激活的LPS在80℃、15 s處理后對以上微生物無作用或只有些少許作用［17］。Wendie等綜述報道經過72℃、15 s巴氏殺菌，LPO的活性為加熱前的70%，在這種加熱條件下，LPO仍保持其全部的生物活性，經過UHT處理后LPO沒有活性［18］。純化分離的LPO經70℃、15 min殺菌后，LPO依然是穩定的，而78 ℃、15 s時完全失活［19］。

Tayefi-Nasrabadi等研究得出，牛乳中LPO的活性在 67、69、71、73 ℃ 的 D 值分別為 116.27、31.05、9.78、6.77 min;牛乳中 LPO 的 Z 值為 4.7 ℃［20］。Lorenzena等指出牛乳中LPO的活性經過75℃、28 s加熱后為原料乳的50% ～60%，同時發現原料乳的LPO 活性為(2 940 ±40)U/L，經過 35、45、55、65、75、85℃加熱90 s后，活性分別為(2 550±50)、(2425±25)、(2375 ±75)、(1913 ±38)、(338 ±19)、＜5U/L［21］。Dumitrascu 等得出牛乳中 LPO 在 70、71、72、73、75、77 ℃的 D 值分別為(89.52 ±10.69)、(42.88±3.38)、(22.97 ± 0.70)、(13.59 ± 1.02)、(3.58 ±0.14)、(0.77 ± 0.14)min，Z 值為(3.58 ± 0.004)℃［22］。LPO鈍化溫度的差異主要是由于牛乳樣品中脂肪含量的差異引起［23］，也可能是由于體系中酸度不同引起，原因是LPO在酸性條件下熱穩定性下降［24］。有研究認為LPO的熱穩定性與其結構高度有序相關，LPO中含有8個二硫鍵和鈣離子［25］，然而這一假設需要進一步驗證。

3 熱處理對免疫球蛋白生物活性的影響

3.1 免疫球蛋白的熱穩定性

免疫球蛋白是牛初乳和常乳里最重要的免疫活性蛋白，牛乳中的免疫球蛋白主要有IgA(Immunoglobulin，IgA)，IgG(Immunoglobulin，IgG)，IgM(Immunoglobulin，IgM)。免疫球蛋白相對于其他乳清蛋白更易變性，因而免疫球蛋白熱穩定性的相關研究較多。

Mainer等通過對比免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)經過62～81℃熱處理后的熱變性情況，指出IgG最耐熱，IgM是最不耐熱;低溫長時殺菌(63℃、30 min)IgM將變性30%，而對IgA和IgG不會產生影響;高溫短時殺菌(75℃、15 s)后IgG僅變性1%，IgA變性2%，IgM 變性14%［26］。Ustunol等發現經過80℃、25 min處理后IgA對乳酸乳球菌的結合能力完全失活;85℃、20 min熱處理后IgM完全失活;IgG在85℃、30 min處理后完全失活［27］。Jelena等通過實驗結果得出牛乳中免疫球蛋白受加熱強度的變化，結果見表1 所示［28］。

表1 牛乳中不同免疫球蛋白濃度隨加熱強度的變化Table 1 Changes in concentration of immunoglobulin in milk according to heat intensity

此外，Dominguez等曾證實IgG能夠結合抗原，從而發揮免疫作用，同時發現經過60～65℃、30 min的熱處理后，IgG的活性未發生顯著變化;在69、72、77、81℃加熱時，IgG 的 D 值分別為8 504、1 387、285、52 s;Z 值為 6.6 ℃，活化能為 386.83KJ/mol［29］。

3.2 不同乳體系中免疫球蛋白的熱穩定性

Chen等提出在75～100℃加熱時，牛初乳中的IgG比乳清和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中的IgG更加穩定，經過75℃、5 min的熱處理后PBS緩沖液中的IgG活性降低了40%;經過95℃、15 s的處理后活性降低100%，而乳清和牛初乳中的IgG分別殘留42%和59%。同時，該研究也發現添加一定濃度的果糖、麥芽糖、糖醇(山梨糖醇、麥芽糖醇)、氨基酸(半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、天門冬氨酸)可以增加IgG的熱穩定性［30］。

Li-Chan等［31］將IgG溶解在PBS溶液、煮沸過的牛乳和超高溫滅菌乳中，加熱溫度設定為從62.7℃到80℃，發現IgG經過62.7℃、30 min的處理后活性沒有變化，在72～80℃內，PBS溶液、煮沸過的牛乳和 UHT乳中 IgG 的 Z值分別為 6.7，8.9和 8.5℃，活化能分別為 353.3、258.3、298.5 kJ/mol。商業巴氏殺菌過程不會導致IgG完全破壞，同時也發現在商業加工的產品中，IgG具有結合細菌脂多糖的特異性抗體活性，在HTST巴氏殺菌乳、復原脫脂奶粉和源自切達干酪的乳清中都表現出很高的IgG水平，而罐裝煉乳、UHT乳中很少或根本沒有抗體活性。

3.3 熱誘免疫球蛋白結構的變化

Calmettes等提出，IgG活性損失的原因為其分子經過加熱后發生構象變化，牛初乳IgG活性含量的降低可能是由于熱處理后IgG分子變形或展開而引起的［32］。相對于Fc片段，IgG的 Fab片段中的CH區域相對熱穩定性差，容易展開，使Fab段結構發生變化，IgG失去免疫活性。免疫球蛋白的熱變性過程是一個展開又聚合的復雜過程。在低溫下，三級結構可能發生展開，但某些展開的區域可能發生可逆。不同的熱處理條件對蛋白質變性過程中肽鏈的展開及蛋白質的凝聚反應的強度不同［33-34］。Li等提出在硼酸鹽的中性緩沖液中，IgG改變二級結構的溫度為72℃;當牛乳IgG在82℃加熱120 s后，IgG二級結構中的β-折疊轉變為無規則卷曲，同時IgG的免疫活性發生降低［35］。

4 熱處理對乳中激素、生長因子和細胞活素類成分的影響

4.1 乳體系中的激素、生長因子和細胞活素類成分

乳中的激素和生長因子，有些是完整或經過糖基化和磷酸化等修飾從血液轉入乳中的;有些是在乳腺或乳中經蛋白水解作用形成的;也被認為是在內分泌器官(乳腺)內合成并轉入乳中的。牛乳中細胞活素類物質與乳牛的感染情況密切相關。目前，已報道乳中含有40多種激素、生長因子和細胞活素類物質，例如白細胞介素(interleukin，IL)，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-13，IL-16;γ-干擾素;生長因子，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)，胰島素生長因子(insulin-like growth factor，IGF)，粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)，人巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)，轉化生長因子 (transforming growth factor，TGF)和趨化因子，單核細胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)，巨噬細胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein-1，MIP-1)，受激活調節正常T細胞表達和分泌因子(regulatedupon activation normal T cell expressedand secreted factor，RANTES)和嗜酸細胞活化趨化因子(eotaxin)。

4.2 激素、生長因子和細胞活素類成分的熱穩定性

4.2.1 加熱對胰島素生長因子-I(IGF-I)活性的影響

熱處理可以激活生長因子，Pia等發現，經過65℃和72℃加熱15 s的牛乳中IGF-I的濃度較原料乳高，當原料乳經過90℃、15 s的熱處理后，IGF-I的水平發生急劇增加，而經過135℃、15 s加熱后，IGF-I活性發生降低［36］，指出90℃加熱可以激活 IGF-I。Kang等研究發現，在原料乳中添加凍干的初乳乳清粉能夠增加IGF-I的水平，經過75℃和85℃加熱15 min后，其濃度發生降低，分別為加熱前的45.0%和45.2%［37］;經過121 ℃、15 min 的熱處理后牛乳中沒有檢測出IGF-I活性。

Zhen等從牛初乳中分離出IGF-1，樣品凍干后測定牛乳類胰島素生長因子-I(IGF-I)在2個模型系統(PBS緩沖液和UHT乳)中的熱變性動力學和熱力學參數。結果表明，在選定的加熱溫度(65、72、80、90℃)下，IGF-I在UHT乳中的熱變性D值均高于在PBS緩沖液中的D值;在PBS緩沖液和UHT乳中的熱變性Z值分別為24.41℃和27.12℃;且牛乳IGFI的熱變性反應級數為1.1級。同時對IGF-I在兩個系統中的活化能、吉布斯自由能變、焓變和熵變進行了比較。結果顯示，牛乳IGF-I在UHT乳中有更強的熱穩定性，同時IGF-I較乳清蛋白中的β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG、IgA的熱穩定性要強［38］。

4.2.2 加熱對轉移生長因子 β2(TGF-β2)活性的影響

在有關TGF-β2的研究中，Rogers等發現，巴氏殺菌乳和干酪加工獲得的乳清中TGF-β2的含量分別為 4.3ng/mL 和 3.7ng/mL［39］;Abderrazak 等將含有TGF-β2牛乳在57～84℃加熱2 min，發現加熱溫度達到66℃時，在乳清蛋白中的TGF-β2含量開始降低，加熱溫度達到76℃時，檢測不出TGF-β2的存在［40］。Ollikainen 發現，90 ℃、15 s的熱處理可以激活轉化生長因子 TGF-β2，同時指出盡管未激活的TGF-β2存在于乳清片段中，而激活的TGF-β2卻存在于酪蛋白中［41］。

4.3 熱誘生長因子分子結構的變化

加熱導致的生長因子活性變化與其分子結構相關，分子具有很強的疏水性，這有利于自身聚合和與其他蛋白質的非特異性相互作用。已有研究表明，TGF-β2在Cys-77位有1個游離的巰基［42］，游離巰基可使其與β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、酪蛋白膠粒和脂肪球膜等成分發生反應，從而使其分布在脂肪球表面、酪蛋白膠束和牛乳乳清相中［43］。Sylvie等指出，生長因子多數與牛乳中高分子質量的大蛋白結合，并且以潛在的形式存在，乳中的生長因子能夠耐受巴氏殺菌的加熱強度;二硫鍵還原劑可以鈍化一些生長因子，如TGF-β2;此外，研究也指出由于IGF-I中有3個二硫鍵，而TGF-2中含有9個二硫鍵，所以 TGF-β2耐熱性更強［44］。

5 熱處理對乳中溶菌酶的影響

原料乳中的溶菌酶濃度為0～2 mg/L，平均濃度為 0.60 mg/L［45］。Abd 提出，牛乳中溶菌酶的濃度為(1.67 ±0.65)μg/mL，經過 65 ℃、30 min 的加熱處理后，溶菌酶的濃度降低為(0.71 ±0.22)μg/mL;經過75 ℃、15 s的處理后濃度為(1.60±0.64)μg/mL;與未加熱樣品相比，經過85℃、1 s的處理后，溶菌酶的濃度增加23.87%，提出高溫短時間殺菌可以激活溶菌酶的活性，而低溫長時殺菌會降低該酶的活性［46］。Fox等指出溶菌酶具有一定的熱穩定性，經過75℃、15 min和80℃、15 s的加熱后其活性為加熱前的75%［47］。此外，Jelena等研究了牛乳中溶菌酶濃度隨加熱強度的變化，結果如表2所示［28］。

表2 牛乳中溶菌酶濃度隨加熱強度的變化Table 2 Changes in concentration of lysozyme in milk according to heat intensity

6 結論

目前，有關牛乳中生物活性成分的種類及各種生物活性成分的功能方面的研究較為全面，總體上已經明確了不同生物活性成分的具體生物功能。然而有關不同體系(牛乳體系、初乳粉、分離純化的樣品、PBS緩沖液、乳模擬體系)中各種生物活性成分的測定方法存在不同，又由于不同體系中生物活性成分的含量、濃度和活性均較低，不同研究所報告的結果不可避免的存在一定差異。同時，加熱過程中活性成分變化的分析與討論主要集中于活性的比較層面上，也有針對加熱過程中生物活性成分保護劑(集中于免疫球蛋白)的相關報道。然而，基于熱處理過程中生物活性成分變性或者活性降低的同時，生物功能變化方面的研究相對較少，研究主要集中在活性降低(熱失活)或者升高(熱激活)比例的層次上，而針對加熱導致的乳中活性成分的構效關系的相關研究甚少，主要體現在乳鐵蛋白、免疫球蛋白、乳過氧化物酶、生長因子(IGF-1和TGF-β2)等成分在加熱過程中會通過二硫鍵或者是非共價鍵聚合進行研究，但是缺乏對這些化學鍵及二級結構域的變化與生物活性成分活性降低、變性與復性程度、生物功能的關聯研究，這方面有待于進一步探討。

［1］ Shah N P.Effects of milk-derived bioactives:an overview［J］.British Journal of Nutrition，2000，84(Suppl 1):S3-S10.

［2］ Cheng J B，Wang J Q，Bu D P.Factors affecting the laetoferrin concentration in bovine milk［J］.Joumal of Dairy Science，2008，91(3):970-977.

［3］ Steijns J M，Van Hooijdonk A.Occurence，structure，biochemical properties and technological characteristics of lactoferrin［J］.British Journal of Nutrition，2000，84:11-17.

［4］ Valenti P，Antonini G.Lactoferrin:an important host defence against microbial and viral attack［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，2005，62:2 576-2 587.

［5］ Actor J K，Hwang S A，Kruzel M L.Lactoferrin as a natural immune modulator［J］.Current Pharmaceutical Design，2009，15(17):1 956-1 973.

［6］ Ruegg M，Moor U，Blanc B.A calorimetric study of the thermal denaturation of whey proteins in simulated milk ultrafiltrate［J］.Journal of Dairy Research，1977，44(3):509-520.

［7］ Abe H，Saito H，Miyakawa H.Heat stability of bovine lactoferrin at acidic pH［J］.Journal of Dairy Science，1991，74(1):65-71.

［8］ Sreedhara A，Flengsrud R，Prakash V，et al.A comparison of effects of pH on the thermal stability and conformation of caprine and bovine lactoferrin［J］.International Dairy Journal，2010，20(7):487-494.

［9］ Paulsson M A，Svensson U，Kishore A R.Thermal behavior of bovine lactoferrin in water and its relation to bacterial interaction and antibacterial activity［J］.Journal of Dairy Science，1993，76(12):3 711-3 720.

［10］ Oria R，Ismail M，Sanchez L.Effect of heat treatment and other milk proteins on the interaction of lactoferrin with monocytes［J］.Journal of Dairy Research，1993，60(3):363-369.

［11］ Dupont D，Arnould C，Rolet-Repecaud O，et al.Determination of bovine lactoferrin concentrations in cheese with specific monoclonal antibodies［J］.International Dairy Journal，2006，16(9):1 081-1 087.

［12］ Sanchez L，Peiro J M，Castillo H.Kinetic parameters for denaturation of bovine milk lactoferrin［J］.Journal of Food Science，1992，57(4):873-879.

［13］ Indyk H E.，McGrail I J，Watene G A，et al.Optical biosensor analysis of the heat denaturation of bovine lactoferrin［J］.Food Chemistry，2007，101:838-844.

［14］ Guillaume B，Michel B，Yves P.Heat-induced aggregation of bovine lactoferrin at neutral pH:Effect of iron saturation［J］.International Dairy Journal，2007，17:617-624.

［15］ Korhonen H.A new method for preserving raw milk-The lactoperoxidase antibacterial system［J］.World Animal Review，1980，35:23-29.

［16］ De Wit J N，van Hooydonk A C M.Structure，functions and applications of lactoperoxidase in natural antimicrobial systems［J］.Netherlands Milk and Dairy Journal，1996，50:227-244.

［17］ Marks N E，Grandison A S，Lweis M J.Challenge testing of the lactoperoxidase system in pasteurised milk［J］.Journal of Applied Microbiology，2001，91:735-741.

［18］ Wendie L C，Sabine C，Georges D，et al.Raw or heated cow milk consumption:Review of risks and benefits［J］.Food Control，2013，31:251-262.

［19］ Paul K G，Ohlsson P I.The chemical structure of lactoperoxidase.In Pruitt K M，Tenovuo J O(Eds)，The lactoperoxidase system:Chemistry and biological significance［M］.New York:Marcel Dekker.1985:15-29.

［20］ Tayefi-Nasrabadi H，Hoseinpour-fayzi M A，Maryam M.Effect of heat treatment on lactoperoxidase activity in camel milk:a comparison with bovine lactoperoxidase［J］.Small Ruminant Research，2011，99:187-190.

［21］ Lorenzena P C，Martina D，Clawin-Radecker I，et al.Activities of alkaline phosphatase，glutamyltransferase and lactoperoxidase in cow，sheep and goatilk in relation to heat treatment［J］.Small Ruminant Research，2010，89:18-23.

［22］ Dumitrascu L，Stanciuc N，Stanciu S，et al.Thermal inactivation of lactoperoxidase in goat，sheep and bovine milk-A comparative kinetic and thermodynamic study［J］.Journal of Food Engineering，2012，113:47-52.

［23］ Claeys W L，Ludikhuyze L R，van Loey A M，et al.Inactivation kinetics of alkaline phosphatase and lactoperoxidase，and denaturation kinetics of beta-lactoglobulin in raw milk under isothermal and dynamic temperature conditions［J］.Journal of Dairy Research，2001，68(1):95-107.

［24］ Van Hooijdonk A C M，Kussendrager K D，Setijins，J M.In vivo antimicrobial and antiviral activity of components in bovine milk and colostrums involved in non-specific defence［J］.Brithish Journal of Nutrition，2000，84(Suppl.1):S127-S134.

［25］ Kussendrager K D，van Hooijdonk A C M.Lactoperoxidase:physicochemical properties，occurrence，mechanism of action and applications［J］.Brithish Journal of Nutrition，2000，84(1)，519-525.

［26］ Mainer G，Sanchez L，Ena J M，et al.Kinetic and thermodynamic parameters for heat denaturation of bovine milk IgG，IgA and IgM［J］.Journal of Food Science，1997，62(5):1 034-1 038.

［27］ Ustunol Z，Sypien C.Heat stability of bovine milk immunoglobulins and their ability to bind lactococci as determined by an ELISA［J］.Journal of Food Science，1997，62(6):1 218-1 222.

［28］ Jelena Z，Inga C.The influence of heat treatment on antimicrobial proteins in milk［J］.World Academy of Science，Engineering and Technology，2012，64:832-836.

［29］ Dominguez E，Perez M D，Calvo M.Effect of heat treatment on the antigen-binding activity of anti-peroxidase immunoglobulins in bovine colostrum［J］.Journal of Dairy Science，1997，80(12):3 182-3 187.

［30］ Chen C C，Chang H M.Effect of thermal protectants on the stability of bovine milk immunoglobulin［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46(9):3 570-3 576.

［31］ Li-Chan E，Kummer A，Losso J N，et al.Stability of bovine immunoglobulins to thermal treatment and processing［J］.Food Research International，1995，28(1):9-16.

［32］ Calmettes P，Cser L，Rajnavolgyi E.Temperature and pH dependence of immunoglobulin G conformation［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，1991，291(2):277-283.

［33］ Arnoldus W P V，Willem N.The Thermal stability of immunoglobulin:unfolding and aggregation of a multi-domain protein［J］.Biophysical Journal，2000，78(1):394-404.

［34］ Elizondo-Salazar J A，Jayarao B M，Heinrichs A J.Effect of heat treatment of bovine colostrum on bacterial counts，viscosity，and Immunoglobulin G concentration［J］.Journal of Dairy Science，2010，93(3):961-967.

［35］ LI S Q，Bomser J A，ZHANG Q H.Effects of pulsed electric fields and heat treatment on stability and secondary structure of bovine immunoglobulin G［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53(3):663-670.

［36］ Pia O，Anne-Maria R.Effects of heat-treatment on insulin-like growth factor-1 in bovine milk［J］.International Dairy Journal，2012，23:73-78.

［37］ Kang S H，Kim J U，Imm J Y，et al.The effects of dairy processes and storage on Insulin-like Growth Factor-I(IGF-1)in milk and in model IGF-1 fortified dairy products［J］.Journal of Dairy Science，2006，89:402-409.

［38］ ZHEN Y Y，HE P，ZHANG X Z，et al.Kinetic and thermodynamic studies on the thermal denaturation of bovine milk insulin-like growth factor-I in model systems［J］.Lait，2007，87:139-148.

［39］ Rogers M L，Goddard C，Regester G O，et al.A.Transforming growth factor-β in bovine milk:Concentration stability and molecular mass forms［J］.The Journal of Endocrinology，1996，151:77-86.

［40］ Abderrazak A，Adil R，Maxime S，et al.Effect of heating on the distribution of transforming growth factor-β2 in bovine milk［J］.Food Research International，2011，44:28-32.

［41］ Ollikainen P.Activation of transforming growth factor-β2 in bovine milk during indirect heat treatments［J］.International Dairy Journal，2011，21:921-925.

［42］ Daopin S，Piez K A，Ogawa Y，et al.Crystal structure of transforming growth factor-β2:An unusual fold of the superfamily［J］.Science，1992，57(5 068):369-373.

［43］ Abderrazak A，Adil R，Maxime S E L，et al.Effect of heating on the distribution of transforming growth factorβ2 in bovine milk［J］.Food Research International，2011，44:28-32.

［44］ Sylvie F G，Yves P，Jean-Louis M.Growth factors from bovine milk and colostrum:composition，extraction and biological activities［J］.Lait，2006，86:99-125.

［45］ Walstra P，Geurts T J，Noomen A，et al.Principles of milk properties and processing in dairy technology［M］.New York:Basel Marcel Dekker.1999:709-727.

［46］ Abd El-Aziz M.Study on lysozyme level，distribution and effect of heat treatment in buffalo and cow milk［J］.Journal Annals of Agricultural Science(Cairo)，2006，51(2):439-446.

［47］ Fox P F，Kelly A L.Review:indigenous enzymes in milk:overview and historical aspects-part 1 ＆ 2［J］.International Dairy Journal，2006，16:500-532.