色譜聯用技術在藥物分析中應用及發展

徐穎　李豪　修佳　等

[摘要]臨床藥物研究中對原料藥和制劑的含量測定日益嚴格，特別是中國藥典中對特殊物質和有機雜質的鑒別和分析日趨復雜，對一些治療窗口窄，安全范圍小的藥物進行血藥濃度檢測迫在眉睫，為優化合成路線，提高藥品質量，藥物分析技術的日新月異為藥物檢測提供保障。本研究對新型色譜聯用技術在分析領域進行分析整理，了解色譜分析技術的特點和進展，為藥物治療和物質檢測提供科學指導。各種分析方法各獨特的優勢，在靈敏度，特征性，檢測速度各有所長。采用色譜聯用技術，可以優勢互補，將是未來發展趨勢。色譜作為分離手段，光譜充當鑒定工具，兩者取長補短，已成為當今分析領域中復雜成分樣品分析的主要方法。

[關鍵詞] 色譜聯用；藥物分析

[中圖分類號] R917 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）22-35-03

色譜技術（hyphenated techniques in chromatography，HTC）是將具有高分離效能的色譜技術與能夠獲得豐富化學結構信息的光譜技術相結合的現代分析技術。目前，隨著臨床藥理學、藥動學、生物藥劑學及治療藥物濃度監測等領域的迅猛發展，各種色譜聯用技術在藥品質量、環境科學、生命科學、法醫學、商業檢驗研究工作中成為最引人矚目的前沿技術之一。色譜技術因其理論的深入研究，技術的日異完善，儀器和組件的不斷更新，使其在分析領域顯示出強大的優勢。

1 氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）

氣相色譜與有機質譜的聯用系統（GC-MS）是最早實現（1957年）的聯用儀。70年代，GC-MS已開始作為商品出售；80年代，已開始普及應用；迄今技術日臻成熟，廣泛應用于醫藥衛生、石油化工、環境保護和生命科學等領域。目前氣-質聯用在聯用技術應用中十分活躍，它的成功應用能使樣品的分離、鑒定和定量一次完成，毛細管氣相色譜與質譜聯用的檢測限已達10-9g～10-12g水平[1]。對于藥物分析的發展也起到了很大的促進作用，例如GC-MS在合成產物的確證，有機合成反應中副產物的鑒定，中藥未知成分的鑒定，藥物代謝物的研究等方面均是最重要的工具之一。

該方法利用了質譜儀掃描快、靈敏度高的特點，而且用電子轟擊離子源（EI）所獲得的質譜，碎片信息量大，重復性好。因此GC-MS聯用儀多具有10萬或幾十萬張質譜的數據庫，以供比對定性。氣相色譜儀可以看作是質譜儀的進樣系統，相反也可以把質譜儀看作是色譜儀的檢測器。因質譜儀

靈敏度高、特征性強、要求分析試樣必須是高度純凈物（除MS-MS聯用技術外），色譜技術為質譜分析提供了色譜純化的試樣，質譜儀則提供準確的結構信息。

雖然GC-MS聯用儀是最成熟的聯用裝置，但由于受樣品的揮發性限制或極性的影響，分析前常常需要衍生化處理后再分析，因此使用范圍不如LC-MS廣泛。但在其分析范圍內該法具有高分辨能力和高靈敏度，仍然是分析工作者經常選擇的方法。

2 高效液相色譜-質譜（HPLC-MS）

高效液相色譜-質譜聯用技術是90年代發展成熟的分析技術，它集HPLC的高分離能力與MS的高靈敏度、極強的結構解析能力、高度的專屬性和通用性、分析速度快于一體，已成為藥品質量控制（包括藥物中微量雜質、降解產物、藥物生物轉化產物的分析鑒定）、藥用植物成分分析、體內藥物和藥物代謝研究中其它方法所不能取代的有效工具[2]。HPLC法可以分離的化合物范圍遠較GC法為大，與GC-MS聯用技術相比較，GC法對樣品的極性和熱穩定性有一定要求，因此在GC-MS聯用技術分析前，樣品的預處理極為重要。LC-MS聯用分析前樣品預處理簡單，一般不要求水解或者衍生化，可以直接用于藥物及其代謝物的同時分離和鑒定。LC-MS技術集液相色譜的高分離能力與質譜的高靈敏度和極強的定性、專屬性于一體，成為其他方法所不能取代的有效分析工具：（1）樣品適用范圍寬。一般不要求水解或者衍生化處理，即可直接用于檢測強極性化合物，如結合型代謝產物。LC-MS可測定的相對分子質量范圍很寬，一般為50～2000m/z，有的儀器可達50～6000m/z，而且能夠檢測多種結構的化合物。（2）檢測靈敏度高。能夠對復雜基質中痕量的組分進行定性和定量分析。（3）可提供結構信息。通過軟電離方式，一級質譜中的準分子離子峰和加合離子峰可以給出分子量信息。（4）利用碰撞誘導裂解能夠進行多級質譜分析，可提供豐富的化學結構信息。HPLC-MS的不足主要為：（1）由于離子化問題，對部分化學成分的響應差，不能分析所有結構類型的化合物。（2）對色譜流動相的組成有限制，不宜使用非揮發性緩沖鹽，揮發性緩沖鹽的濃度也應控制在10mmol/L以下，在一定程度上降低了LC-MS的應用范圍。（3）所提供的化學結構信息尚不足以徹底解決化合物的鑒定問題，尤其對闡明化合物的基團連接位置和立體構型等缺乏證據。隨著科學技術的不斷進步，LC-MS技術還可能得到進一步發展。

3 電噴霧離子-質譜技術（ESI-MS）

ESI-MS是由 Yamashita和Fenn在1984年發明的一種大氣壓電離技術[3]，在大氣壓狀態下各種物質以液體狀態通過各種接口進樣，離子蒸發各種物質，進樣液滴直徑變小，表面離子化加大，電荷密度增加，揮發度高的離子優先從樣孔射出，進入氣相，形成的離子樣品通過錐孔、聚焦透鏡進入質譜儀隨后被檢測出來。其特點是：（1）離子聚集、離子活化，離子肼產生，質荷比分析等都在一個空間中進行，離子傳輸損失減少，碎片峰的干擾大幅減少；（2）通過電噴霧離子化后，樣品進入質譜儀的性態多樣性，有單電荷的準分子離子，有多電荷的生物大分子，包括蛋白質、酶類、核酸和多肽等，在質譜圖上呈現多電荷特征離子峰圖，特征峰突出，使檢測分析質量大幅提高，檢測范圍擴大，在藥物篩選、農藥檢測、中藥成分鑒定等應用前景廣闊。（3）靈敏度高，可以檢測10-8M以下的物質，微量物質的檢測優勢明顯。（4）既可以定性，又可以定量分析，可提供檢測物質的分子結構和分子質量的詳細信息，對于復雜混合物的分析優勢明顯。有學者應用ESI-MS技術對三氯苯達唑原料藥、克林霉素有關物質、長春花生物堿、蓮子心生物堿進行研究分析[4]，均取得很好的分離作用，質譜圖出峰時間短，峰形尖銳，效果明顯，實驗證明ESI-MS技術對藥物分析手段限制小，應用范圍廣闊，在快速鑒定微量物質方面前景廣闊。endprint

4 高速逆流色譜技術（HSCCC）

HSCCC是由美國國立健康研究院Ito Y博士等研發出來的新型液液分配技術[5]，其原理為：不用任何固體作載體，互不相容的兩相溶劑在繞成線圈的聚四氟乙烯管內做高速行星式運轉，當螺旋管分離柱繞公軸以800r/min高速旋轉時，靠近公軸的兩相溶劑混合，遠離共軸的兩相溶劑靜置分層，達到流動力學平衡時，開始進樣，樣品在兩相反復快速分離混合，最終按照分配系數的大小依次洗脫，從而達到分離的目的。隨著分析技術的不斷進步，又開發出正膠軸色譜分離技術（CCC）[6]，雙向逆流色譜技術（DuCCC）[7]，PH-區帶精制逆流色譜技術（PH zone refining CCC）[8]，它們在旋轉原理，固定相和流動相的選擇，解離常數和疏水性的不同各具優勢，對分離天然大分子蛋白、復雜成分中藥分離、食品藥品檢測和環境污染檢測都發揮不可替代的作用。國內外學者使用這項技術分離提純檢測黃酮類化合物，農藥殘留，篩選活性物質等[9-11]都取得理想的分離目的。分析型HSCCC還可以與光譜或色譜連用，發揮各自優勢，建立中藥指紋圖譜，確定化合物分子結構發揮重要作用。HSCCC以其分辨率高，洗脫方式多樣，重現性好，與其他分析儀兼容性強，性能可靠在天然藥物研究中發揮重要作用。

5 免疫親和色譜技術（LAC）

免疫親和色譜技術是利用含偶聯抗體的固定相做親和層析住，選擇性可逆吸附待測物抗原物質，達到從復雜化合物中分離提純目標物的目的[12]。在LAC應用中，有目的依據不同化合鍵作用原理，有目的的選擇親和配位體，發揮對目標分子獨特的親和能力，識別特征物質?？赏瑫r進行篩選天然藥物的活性成分和不同成分的分離[13]。利用被測物質反應原性，待測物質粗提液流經免疫吸附柱時，對抗體有特殊親和力的抗原物質吸附到色譜柱，使被測物質選擇性的提取和濃縮[14-15]。其特點是：（1）專屬性、選擇性強，只有特定的抗原抗體復合物可以識別；（2）提純、富集效果好，由于只對特性集團產生吸附作用，操作簡便，分離度高。（3）可重復使用，對色譜柱毒化作用低，可反復活化使用?，F與其他色譜技術聯合分析方法多種，固定化金屬親和色譜（IMAC），凝集素親和色譜（ALAC），細胞膜親和色譜（CMC），分子烙印親和色譜（MIC）等[16]。親和色譜技術應用廣泛，純化分離天然藥物活性蛋白，篩選天然藥物活性成分，對天然藥物質量控制，研究天然藥物作用機制等都發揮都特作用。

6 近紅外光譜（NIRS）技術

近紅外光譜（near-infrared spectrophotometry，NIRS）是一種用于鑒定有機物質十分有用的技術。近紅外光譜是中紅外光譜（mid-infrared spectrum，MIRS；2500～25000nm）中C-H，N-H，O-H和S-H的共振吸收，具有高信息量。波長范圍為780～2526nm（12820～3959cm-1），而且該光譜取決于粒子大小、多晶型、殘留溶劑、濕度等等因素，因此待測物光譜的鑒定不可能直接與參比物質光譜比較后確定，常常需要將所得數據經合適有效的數學處理后方能進行[17]。近紅外光譜技術具有操作簡便、分析速度快、無需耗損樣品和化學試劑，及易于實現現場分析等特點[18]。隨著計算機技術的不斷發展，在藥物分析領域得到愈益廣泛的應用。

藥品快速檢驗技術是運用在藥品檢驗上一項新的技術，這一新技術的研究和發展對于及時發現假劣藥品發揮著重要的作用。運用快檢技術是現場檢查中提供發現假劣藥品的初篩手段和方法，同時對可疑藥品進行暫控，大大縮短了抽檢周期。同時也節省了資源，提高了監督抽驗的陽性率，而且可以防止假劣藥品的轉移和流失，有效的打擊不法分子，為廣大人民群眾用藥安全有效做出很大貢獻，進一步凈化了我們的藥品市場。目前近紅外快速鑒別系統具有400多個通用定性分析模型，40個定量分析模型，基本可以滿足市場中的常見藥品快速篩查[19]?；瘜W系統鑒別法將常用的13類化學藥品按其結構分別建立了37個鑒別系統，實現了對同系物藥物的互相區分，可以對各類制劑的560余種藥品實行快速鑒別。中成藥化學快速鑒別系統可對182種中成藥實現了快速鑒別。中藥材快速鑒別系統已經建立了230種中藥材的快檢方法[20]；藥品信息查詢技術可實現對19余萬條藥品質量信息數據的實時查詢。

藥物分析技術的不斷進步，色譜技術的飛速發展，為臨床藥物檢測，中藥復雜成分分析，食品安全環境污染檢測提供保障。色譜技術正朝著聯用化，智能化，微量化，自動化發展。隨著各個學科不斷滲透，更多新的色譜技術還會不斷涌現，檢測手段也會日益豐富。

[參考文獻]

[1] 李娟，任路靜，孫冠男，等.氣相色譜-質譜聯用技術及其在代謝組學中的應用[J].生物工程學報，2013（4）：434-446.

[2] Kaiser P，Akerboom T，Wood WG.A novel LC-DMS/MS method for the determination of the cardiac glycosides digoxin and digitoxinusing caesium adducts[J].Clin Lab，2006，1-2（52）：37-42.

[3] Yamashita M，Fenn JB.Electrospray ion source：Another variation on the free-jet theme[J].J Phy Chem， 1984，88：4450.

[4] 周慧.電噴霧質譜及其聯用技術在藥物分析中的應用[D].杭州：浙江大學，2005：12-13.

[5] Ito Y.New continous extraction method with a coil pianet centrifuge[J].J Chromatogr，1981，207：161-170.endprint

[6] 黃寶康，秦路平，鄭漢臣，等.高速逆流色譜技術在天然產物分離及中藥質控中的應用[J].中藥材，2001（10）：757-761.

[7] 陳亞麗.反相氣相色譜技術表征咪唑基離子液體物化性質的方法學研究[D].烏魯木齊：新疆大學，2013：37-38.

[8] 陳建蘭，李慶山，王漢平，等.變性高效液相色譜技術定量檢測急性髓細胞白血病FLT3基因內部串聯重復突變方法學的建立[J].中國病理生理雜志，2011，27（9）：1852-1856.

[9] 邸多隆，鄭媛嬡，陳小芬，等.高速逆流色譜技術分離純化天然產物中黃酮類化合物的研究進展[J].分析化學，2011，39（2）：269-275.

[10] 歐霞，李勁平，佘志堅，等.高速逆流色譜法在天然藥物研究中的應用概況[J].中南藥學，2014（3）：246-250.

[11] 黃寶康，秦路平，鄭漢臣，等.高速逆流色譜技術在天然產物分離及中藥質控中的應用[J].中藥材，2001（10）：757-761.

[12] 張丹妍，馬明福，張丹媚，等.聚合酶鏈式反應-變性高效液相色譜技術在唐氏綜合征篩查中的應用[J].癌變·畸變·突變，2012（1）：71-74.

[13] 吳笑春，高月.時間分辨熒光免疫分析法在血液地高辛濃度分析中的應用[J].中國醫院藥學雜志，1994（2）：83-85.

[14] 劉望才，朱家文.親和色譜技術研究進展[J].上?；?，2007，32（4）：27-29.

[15] 王煒，侯艷.淺談免疫親和色譜技術的應用[J].黑龍江科技信息，2012（7）：113-114.

[16] 陳芳有，羅永明，吳樣明，等.親和色譜技術在天然藥物研究中的應用[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（11）：230-234.

[17] 謝青.現代色譜技術在中藥指紋圖譜研究中的應用[J].海峽藥學，2007，19（11）：95-98.

[18] 丁東.近紅外光譜技術及其在生物醫學中的應用研究[D].長春：吉林大學，2004.

[19] 孫學惠，郭濤，劉濤，等.藥物檢測新技術在藥代動力學中的應用[J].中國藥房，2002，13（9）：566-567.

[20] 雷利利，張熙潔，侯林中，等.現代色譜技術在中藥制劑多指標成分質量控制中的應用[J].中國藥房，2011，22（39）：3733-3735.

（收稿日期：2014-08-02）endprint