DPPH 法評價大黃提取物的抗氧化活性

閆海燕

(寶雞文理學院 陜西省植物化學重點實驗室，陜西 寶雞 721013)

研究表明，自由基與人體許多疾病的發生都有著密切的關系。在正常的生理狀態下，體內自由基會不斷產生，并不斷地被清除，使之維持在一個正常的生理水平上，過多或過少都會給人體造成損傷。因此，研究自由基的檢測方法具有十分重要的意義。大黃是我國傳統中藥材之一，具有多種藥用功效，隨著大黃研究的不斷深入，從中挖掘抗氧化藥物很有希望［1］。

本實驗采用DPPH 自由基清除法對大黃進行了抗氧化能力的測定，為進一步研究其抗氧化活性及開發利用提供參考。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

大黃，寶雞方晟藥業公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，Sigma 公司;甲醇，色譜純。

CP225D 電子天平;XS2 酶標儀;R-1002 型旋轉蒸發儀;KQ5200E 型數控超聲波清洗器。

1.2 大黃抗氧化成分的提?。?］

準確稱取0.5 g 大黃藥材，加入50 mL 溶劑，超聲提取，減壓回收得大黃粗提物。用甲醇溶解，定容于10 mL 容量瓶中，備用。

1.3 抗氧化性能測試

1.3.1 DPPH 溶液的配制及標準曲線的繪制精密稱取DPPH 0.021 2 g，加甲醇溶解，定容至50 mL量瓶中，得0.424 mg/mL 的儲備液。分別精密移取1，2，4，6，8 mL 于5 個10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。以甲醇為參比，在517 nm 波長處測定各溶液的吸光度。根據吸光度和質量濃度繪制標準曲線，得線性回歸方程為Y = 0. 998 1X +0.031 8 (r=0.999 1)，DPPH 在質量濃度為0.042 4～0.339 2 mg/mL 范圍內線性關系良好。

1.3.2 自由基清除率的測定稱取DPPH 標準品8 mg，甲醇溶解定容至100 mL，得質量濃度為0.08 mg/mL的DPPH 溶液。在96 孔板中，每孔分別加入100 μL 不同濃度的樣品溶液和等體積的DPPH 溶液，室溫避光靜置30 min，于517 nm 波長處測定吸光度Ai;同時測100 μL 甲醇與100 μL DPPH 混合后吸光度Ao;100 μL 樣品液加100 μL 甲醇混合后吸光度Aj。每個樣品平行測定4 次，取其平均值，按下列公式計算清除率:

2 結果與討論

2.1 大黃抗氧化成分提取條件

分別測試1.2 節中各種因素對大黃提取物清除DPPH 能力的影響，結果見圖1。

圖1 大黃抗氧化活性物質提取實驗結果Fig.1 Results of experiments for extracting antioxidants from Rheum palmatum L.

由圖1 可知:①除了用水作溶劑提取物清除率稍低外，其余幾種溶劑提取物均有較強的清除能力，其中乙醇提取物抗氧化能力最強，甲醇提取物次之，由于乙醇具有價廉易得等優點，所以選用乙醇作為提取溶劑;②當乙醇濃度達70%時，大黃抗氧化能力最強;隨著乙醇濃度進一步增加，抗氧化能力卻出現下降趨勢，這可能是由于乙醇濃度過高，一些雜質大量溶出，從而影響大黃抗氧化能力，所以選擇70%乙醇進行提取;③當采用70%乙醇提取時，大黃提取物抗氧化能力在提取30 min 時最強，隨著提取時間的增加反而減小，這可能是由于超聲時間過長，溶液溫度升高，溶液中雜質增多粘度增大，從而影響抗氧化物質的溶出［3］，故選定超聲時間為30 min;④用70%乙醇提取，提取時間為30 min，大黃提取物抗氧化能力隨料液比增加而增大，說明料液稀釋度增加有利于抗氧化物質的溶出，但隨料液比≥1∶40(g/mL)后抗氧化能力反而減弱?？紤]到溶劑耗量和回收等實際問題，最終選擇1∶40 g/mL的料液比。

當上述條件不變，超聲次數為1，2，3 次時，所得提取物對DPPH 自由基的清除率依次為95.08%，96.89%，97.01%，考慮到資源的合理利用，所以以2 次提取較為合理。

另外，對不同提取方法進行對比，超聲提取、浸提、回流提取清 除率分別為96. 89%，94. 7%，88.96%?？梢姵曁崛∥镒杂苫宄首罡?。

2.2 大黃不同極性提取物抗氧化活性研究

2.2.1 大黃不同極性提取物的制備［4］精密稱取大黃藥粉50 g，以2.1 節的優化提取條件進行提取，提取液減壓濃縮至干，用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇進行萃取，回收溶劑，得到4 個不同極性提取物。取各提取物適量置于蒸發皿中，真空干燥備用。

2.2.2 樣品溶液配制分別精密稱取石油醚、乙酸乙酯、氯仿及正丁醇浸膏0.002 2 g，用甲醇溶解，定容至1 mL 樣品管中，作為樣品溶液。

2.2.3 不同極性提取物的清除率曲線將樣品溶液分別用甲醇稀釋，配制成質量濃度為0.02，0.04，0.08，0.12，0.16，0.2，0.4，0.6，2 mg/mL 的樣品溶液，根據1.3.2 節的測定方法，分別加入相同體積的DPPH 溶液，測定其吸光度，以各極性提取物不同質量濃度下的清除率為縱坐標，各極性提取物質量濃度為橫坐標作圖，得到不同極性提取物的清除率曲線，結果見圖2。

圖2 大黃不同極性部位的清除率曲線Fig.2 The clearing rate curves of different polar fractions from Rheum palmatum L.

由圖2 可知，各提取物均有較強的清除DPPH自由基作用，其中石油醚、乙酸乙酯提取物的清除DPPH 自由基能力最強，正丁醇提取物次之，氯仿提取物的作用較弱。

3 結論

以提取物清除DPPH 自由基能力為評價指標，大黃抗氧化物質的提取條件為:70%的乙醇為溶劑，料液比1∶40 g/mL，超聲提取2 次，每次提取30 min;大黃不同極性提取物進行抗氧化活性測試。結果表明:各提取物均有較好的清除DPPH 自由基作用，這可能是由于經過不同極性試劑提取后，具有抗氧化能力的活性物質濃度、純度較高，從而表現出較好的抗氧化活性。其中石油醚提取物和乙酸乙酯提取物在DPPH 自由基清除體系中活性最強。當質量濃度增大到2.0 mg/mL 時，石油醚提取物清除率可達到92.7%，說明大黃是一種優良的抗氧化劑。

［1］ 王春霖. 大黃的研究進展［J］. 甘肅科技，2013，29(14):147-149.

［2］ 呂慧英，趙晨曦，吳海，等. 大黃提取物抗氧化活性與游離蒽醌相關性的研究［J］. 中草藥，2010，41(3):412-415.

［3］ 苑子夜，蘇印泉，張強，等.DPPH 法測定杜仲葉提取物的抗氧化活性［J］. 西北林學院學報，2011，26(6):119-123.

［4］ 董秀英，呂青濤，張國英，等.DPPH 法測定九州蟲草不同極性部位抗氧化活性［J］. 中國實驗方劑學雜志，2011，17(10):70-73.