微波、超高壓處理對轉基因大豆外源基因降解的影響

王衛國 朱占齊 吳興泉

（河南工業大學生物工程學院，鄭州 450001）

微波、超高壓處理對轉基因大豆外源基因降解的影響

王衛國 朱占齊 吳興泉

（河南工業大學生物工程學院，鄭州 450001）

為了考查不同微波和超高壓處理條件對轉基因大豆外源基因CP4-EPSPS降解的影響。試驗對轉基因大豆樣品分別微波處理1、2、3、4、5 min或分別用 100、200、300、400、500 MPa超高壓處理 10 min，采用PCR檢測技術，分析了受處理樣品和未處理樣品中大豆外源基因的降解結果。結果表明：在微波處理條件下，抗草甘膦轉基因大豆的基因組質量濃度隨微波處理時間的增加而降低，當處理時間超過3 min和5 min后，其質量濃度降至9 ng／μL和0 ng／μL，PCR檢測結果顯示，外源基因已被降解到100 bp以下；超高壓處理條件下，抗草甘膦轉基因大豆基因組質量濃度隨著壓力的增加而降低，當壓力為500 MPa時，基因組的質量濃度降至40 ng／μL，但仍能檢測到1 512 bp長度的外源基因片段。與超高壓處理相比，微波處理對大豆外源基因的降解更有效。

轉基因大豆 CP4-EPSPS 微波 超高壓 降解

抗草甘膦轉基因大豆，是在傳統大豆中轉入外源基因CaMV-35S啟動子、抗草甘膦基因CP4-EPSPS和NOS終止子而得到的。在飼料食品加工過程中，采用恰當的方法將轉基因大豆的外源基因充分降解而使其失去活性是近年來廣受關注的研究課題。

食品或飼料的粉碎、蒸汽處理、酸堿處理、焙烤、煮沸、擠壓膨化等加工方法對轉基因大豆外源基因影響的研究已有部分報道［1-5］。但微波處理對轉基因大豆外源基因影響的研究較少，而超高壓處理對轉基因大豆外源基因的影響未見報道。本試驗的目的是了解微波處理和超高壓處理條件對轉基因大豆外源基因CP4-EPSPS的降解作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品

轉基因大豆樣品：鄭州陽光油脂有限公司。

1.1.2 CP4-EPSPS基因擴增引物

從Genbank中查詢轉基因大豆Roundup Ready的P4-EPSPS的基因序列號為 AY125353，其DNA共有 1 946 bp［6］。根據文獻［7-9］，設計了擴增不同長度CP4-EPSPS基因片段的引物（引物序列見表1），所有引物均由英駿生物技術有限公司合成。

表1 抗草甘膦轉基因大豆外源基因特異性引物序列

1.1.3 試劑

DP-320試劑盒：天根生化科技有限公司；Taq酶、dNTPs、PCR緩沖液、分子量 Marker（100 bp-2 000 bp）：鄭州久是生物技術有限責任公司。

1.1.4 主要儀器與設備

9FQ20錘片粉碎機：江西紅星機械廠；梯度PCR儀：德國Bio-metra公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；紫外凝膠成像系統：美國Bio-rad公司；900X2超高壓設備：包頭軍工廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品水分的測定

按 GB／T 5497—1985［10］測定樣品的水分。

1.2.2 樣品的前處理

挑選籽粒飽滿的大豆，粉碎并過60目篩，備用。

1.2.3 微波處理抗草甘膦轉基因大豆粉

從經過前處理的備用大豆粉中取5個樣品，每個樣品量為3.0 g，加入410μL雙蒸水，使大豆粉的含水量達到20%，放入微波爐中（輸出功率為800 W），按表2方案分別加熱處理，然后冷卻，提取基因組，進行質量濃度測定和電泳。每個處理3個重復。

表2 抗草甘膦轉基因大豆微波處理參數

微波加熱的時間參考有關微波加熱大豆的研究文獻確定［11-12］。

1.2.4 超高壓處理抗草甘膦轉基因大豆粉

常壓密封：取20 g大豆粉溶于100 mL去離子水，經真空包裝機密封備用。

超高壓處理：將常壓真空密封的5個樣品分別按表3進行超高壓處理，每個樣品恒壓10 min。超高壓處理采用的壓力范圍和時間參考文獻［13-14］確定。

打開包裝袋，真空抽濾，常溫常壓風干后提取基因組，進行質量濃度測定和電泳。每個處理做3個重復。

表3 抗草甘膦轉基因大豆超高壓處理參數

1.2.5 DNA提取

收集經各工藝條件加工的樣品以提取DNA。稱取固體樣品60 mg，所有樣品均采用試劑盒進行DNA提取，方法按照說明書進行。

1.2.6 抗草甘膦轉基因大豆DNA質量濃度檢測

采用紫外可見光光度計法測定抗草甘膦轉基因大豆基因組的質量濃度，按式（1）計算：

式中：cm為總 DNA質量濃度 ng／μL；OD260為紫外可見光光度計讀數；λ為50 ng／μL。

1.2.7 PCR擴增

研究檢測了抗草甘膦CP4-EPSPS目的基因的4條長度不等的片段，使用未加工轉基因大豆外源基因作模板DNA陽性對照，確保試驗操作和體系正常，雙蒸水空白對照無檢測產物出現，說明PCR操作過程無污染。

本試驗建立和優化的抗草甘膦轉基因大豆粉PCR檢測方法均采用相同的PCR反應體系，總反應體積 50μL，10×Buffer 5μL，dNTPs（10μmol／L）2μL，引物（10μmol／L）2μL，Taq酶1 U，模板 DNA 1μL（約100 ng），加雙蒸水補足至50μL。

反應在PCR儀上進行，4條不同長度片段的PCR檢測反應條件如表4所示。

表4 PCR檢測反應條件

1.2.8 最低檢測限分析及序列測定

將質量濃度約為50 ng／μL的轉基因大豆DNA和雙蒸水分別按體積比為1∶1、1∶3、1∶7、5∶95、1∶99的比例充分混合，雙蒸水為空白對照，按1.2.5優化的PCR檢測方法進行檢測，確定加工處理樣品總DNA的最低檢測限。

將陽性檢測產物進行測序，4條片段分別隨機測定一個反應，以避免出現假陽性。1.2.9 PCR擴增產物檢測

PCR擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠上90 V電泳45 min，用凝膠成像儀觀察結果。

2 結果與分析

2.1 轉基因大豆的水分含量

按1.2.1的GB／T 5497—1985測得的轉基因大豆的水分質量分數為9.06%。

2.2 微波處理抗草甘膦轉基因大豆DNA的質量濃度

微波處理的抗草甘膦轉基因大豆基因組質量濃度的測定結果如表5所示。

表5 經微波處理的抗草甘膦轉基因大豆的基因組質量濃度

由表5可見，未加工轉基因抗草甘膦大豆DNA的質量濃度約為94 ng／μL，在微波處理的條件下，隨著處理時間的增加，提取的DNA質量濃度逐漸降低。當微波處理3 min時，提取的基因組質量濃度驟然降低，當微波處理5 min時，其質量濃度無法檢測，幾乎為零。A260／A280接近 1.8，A260／A230接近2.5，說明提取的基因組純度較高，沒有蛋白、碳水化合物等雜質的污染。

2.3 抗草甘膦轉基因大豆微波處理后外源基因CP4-EPSPS的降解變化

微波處理后轉基因大豆基因的電泳圖見圖1。大豆外源基因CP4-EPSPS的PCR檢測結果見圖2。檢測中，以未經處理的轉基因大豆的外源基因的檢測結果作為陽性對照，檢測了抗草甘膦CP4-EPSPS目的基因的4條梯度片段。

圖1 微波處理的抗草甘膦轉基因大豆基因電泳圖

在微波處理過程中，對應處理時間1、2、3、4、5 min，樣品吸收的能量分別為 48、96、144、192、240 kJ。結合表2、圖1和圖2進行分析可知，隨著微波處理時間的增加，樣品中DNA質量濃度急劇下降，當處理時間達到3 min時，其DNA質量濃度僅有9 ng／μL左右；由PCR檢測結果可以看出，微波處理1～2 min后，還可以檢測出4個條帶（圖2 a～圖2d），表明，外源基因尚未被充分降解。當微波處理時間超過3 min之后，已檢測不到≥100 bp的外源DNA片段（圖2 a～圖2d）。表明，外源基因已經被充分降解。100 bp以下的外源DNA片段已無原有的基因活性。

圖2 微波處理抗草甘膦轉基因大豆外源基因CP4-EPSPS的PCR檢測

2.4 超高壓處理抗草甘膦轉基因大豆DNA的質量濃度

超高壓處理的抗草甘膦轉基因大豆基因組質量濃度的測定結果如表6所示。

表6 超高壓處理抗草甘膦轉基因大豆基因組質量濃度

由表6可見，A260／A280接近1.8，A260／A230接近2.5，說明提取的基因組純度較高，沒有污染。與未處理的轉基因大豆的基因組質量濃度相比，隨著壓力的增強，超高壓處理大豆粉的DNA質量濃度降低，但當壓力達到500 MPa時，轉基因大豆提取的基因組的質量濃度仍有約40 ng／μL，是未處理大豆所提取的基因組質量濃度的1／2左右，表明超高壓處理對大豆基因組的降解或破壞作用遠低于微波處理的作用。

2.5 超高壓加工對轉基因大豆外源基因CP4-EPSPS的降解作用

本研究檢測了抗草甘膦CP4-EPSPS目的基因4條梯度片段，在檢測的過程中，以未處理轉基因大豆外源基因為模板DNA進行檢測的結果作為陽性對照，確保試驗操作和體系正常，雙蒸水空白對照無檢測產物出現，說明PCR操作過程無污染。

圖3 超高壓處理后的抗草甘膦轉基因大豆基因組電泳圖

從電泳結果可以看出，以未經超高壓處理的樣品DNA作為模板，對CP4-EPSPS基因不同長度片段進行檢測，各處理樣品均可檢測出4條不同長度片段的條帶，說明即使經500 MPa的壓力處理10 min，外源基因也未完全降解 （圖4），仍能檢測出1 512、807、408、206 bp大小的片段（圖 4），僅1 512 bp片段的濃度有所降低。

圖4 經超高壓處理的抗草甘膦轉基因大豆外源基因CP4-EPSPS的PCR檢測

3 討論

3.1 微波處理對抗草甘膦轉基因大豆外源基因的影響

抗草甘膦轉基因大豆在2 450 MHz微波作用下，所含水分、蛋白質等電解質分子隨電場的變化發生高速振動，造成分子間的碰撞和劇烈摩擦，從而產生高熱，在較短的時間內會使蛋白質的結構變得松散、降解。張海華等［15］的研究結果表明，微波在加熱功率為600、800、1 000 W加熱1 min，可削弱面筋蛋白分子間或分子內的非共價作用，使部分二硫鍵斷裂，使面筋蛋白緊密的結構變得松散。而當微波處理時間加長至2 min以上時，由于水分損失，植物籽粒內溫度迅速上升，超過100℃，可使轉基因植物外源DNA發生有效降解。Song等［16］用微波爐（800 W）處理經煮熟、揉捏、成型、冷卻的抗除草劑轉基因大米（湘 125S／Bar 68-1）片3 min，其SPS基因（7 150 bp）僅可檢測出916、456、277、168 bp的基因片段，而Bar基因（615 bp）僅可檢出370 bp和175 bp大小的基因片段。CAMV35S啟動子（835 bp）可檢測出735、446、195 bp的片段，對 NOS終止子（253 bp）則僅測出180 bp大小的片段。表明不同外源基因和調控原件在相同微波處理條件下的穩定性是不同的，這與其蛋白自身結構與特性相關。Vijayakumar等［17］研究了微波熱加工對轉基因大豆的影響。用540 W和900 W微波處理樣品2 min，GM大豆的DNA濃度從100 ng／mg分別下降到約76 ng／mg和53 ng／mg。從微波處理的GM大豆中可以檢測到101 bp的EPSPS的基因片段。本試驗結果表明，微波加熱1 min時，DNA質量濃度下降約1／3，說明部分GM大豆的DNA結構發生了降解。微波加熱2 min內，GM大豆DNA濃度的下降趨勢與Vijayakumar等［17］的研究結果相同。而從提取的DNA中可以擴增出1 512、807、408、206 bp的外源 CP4-EPSPS基因的片段。當微波處理3 min及以上時，已檢測不到≥100 bp的外源基因片段。表明GM大豆的外源基因已經嚴重變性降解甚至焦化。

3.2 超高壓對抗草甘膦轉基因大豆外源基因的影響

超高壓加工是在低溫、室溫和溫和加熱的條件下采用100～900 MPa壓力對食品進行殺菌和殺滅有害微生物而很少影響食品新鮮度、質構、色澤風味的物理加工方法［18］。通常認為，在高壓作用下，形成高分子立體結構的氫鍵、離子鍵等非共價鍵發生變化，而共價鍵不發生變化，即小分子物質不被破壞。曾慶梅等［19］研究了超高壓參數對大腸桿菌DH5質粒DNA的影響，結果表明，在25℃經300、400、500 MPa壓力處理15 min后，樣品吸光度與未經高壓處理樣品相比吸光度上升，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示大腸桿菌 DH5質粒 DNA經超高壓（300、400、500 MPa）處理后條帶增多，表明超高壓處理影響了質粒DNA的結構。而蘇丹等［14］就超高壓處理對大豆分離蛋白結構影響的研究表明，400～600 MPa下處理20 min，大豆蛋白巰基含量和表面疏水性都明顯增加，大豆蛋白的亞基組成發生明顯變化，可使蛋白質由較大的顆粒解聚成較小的顆粒。本研究結果顯示，以500 MPa壓力處理樣品10 min后，樣品的基因組質量濃度比未處理組降低55.7%，但仍能檢出1 512、807、408、206 bp的外源基因片段，僅1 512 bp片段的濃度有明顯降低。說明超高壓處理不能有效降解抗草甘膦轉基因大豆的外源基因DNA。

4 結論

4.1 本試驗條件下，微波處理≥3 min時，能有效降解抗草甘膦轉基因大豆的外源基因CP4-EPSPS，樣品中已經檢測不出100 bp以上的CP4-EPSPS基因片段。

4.2 經100～500 MPa的超高壓處理10 min，不能有效降解抗草甘膦轉基因大豆的外源基因CP4-EPSPS。

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The Effect of Microwave and Ultra-High Pressure Parameters on the Degradation of Exogenous DNA of GM Soybean

Wang Weiguo Zhu Zhanqi Wu Xingquan
（Bio-engineering College，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001）

The purpose of this experiment is to study the effects of microwave and ultra-high pressure parameters on the degradation of exogenous DNA CP4-EPSPS of GM soybean.The GM soybean samples were treated for 1，2，3，4 and 5 min separately by microwave，or treated by 100，200，300，400 and 500 MPa pressure respectively for 10 min.Then the samples both treated and untreated were tested for the degradation of exogenous gene of GM soybean by qualitative PCR detection method.The results showed that Roundup Ready soybean genome concentration decreased with the increasing of microwave treating time.When the treating time reached 3 min and 5 min，the genome concentration reduced to 9 ng／μL and 0 ng／μL.PCR test results showed that exogenous gene has been degraded to smaller than 100 bp；For the ultra-high pressure treatment，the genome concentration decreased with the increase of pressure.After 500 MPa treatment，the concentration of the genome reduced to 40 ng／μL，fragments of 1 512 bp could still be detected out.Comparing with the ultra-high pressure treatment，microwave treatment was more effective to the degradation of exogenous gene of GM soybean.

GM soybean，CP4-EPSPS，microwave，ultra-high pressure，degradation

S816.9

A

1003-0174（2015）02-0020-06

“十二五”國家科技支撐計劃（2011BAD26B0401）

2013-09-20

王衛國，男，1956年出生，教授，飼料加工新技術