高效液相色譜法同時測定飼料添加劑中6種有機酸含量

趙 艷 張鳳枰 楊發樹 劉耀敏

（水產畜禽營養與健康養殖農業部重點實驗室通威股份有限公司，成都 610041）

高效液相色譜法同時測定飼料添加劑中6種有機酸含量

趙 艷 張鳳枰 楊發樹 劉耀敏

（水產畜禽營養與健康養殖農業部重點實驗室通威股份有限公司，成都 610041）

建立高效液相色譜法同時分離測定飼料添加劑中的甲酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丙酸、苯甲酸含量的方法。樣品用鹽酸溶液（0.1%）∶乙腈（1∶1）超聲提取，應用ZORBAX SB-C18色譜柱，以乙腈和鹽酸溶液（0.1%）為流動相進行梯度洗脫，紫外檢測器在210 nm處進行檢測，外標法定量。結果表明，6種有機酸線性關系良好，相關系數均為0.999 9，回收率96.5%～103.2%，變異系數0.94%～4.15%，甲酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丙酸、苯甲酸檢出限分別為檢出限分別為0.1、1.0、1.0、0.5、0.5、0.02μg／mL。該方法操作簡便、靈敏度高、重現性好，適用于飼料添加劑中6種有機酸含量的測定。

高效液相色譜法 飼料添加劑 有機酸

飼料添加劑中的有機酸主要有可以降低飼料和胃腸道的pH值，抑制有害菌，促進有益菌的生長繁殖，促進酶原的活化、提高酶的活性、促進動物對營養物質的消化和吸收等作用，因此，飼料中有機酸主要作為飼料的酸味劑被廣泛使用。目前，有機酸測定的方法有氣相色譜法［1-2］、氣質聯用法［3-4］、離子色譜法［5-8］、毛細管電泳法［9-11］、高效液相色譜法［12-15］等。氣相色譜法和氣質聯用法雖具有較強的專屬性，但其只能適用于少數低沸點有機酸含量的測定，且儀器維護成本較高。高效液相色譜法是目前有機酸分析的常用液相色譜方法，其特異性強、準確度高，可用于多種有機酸的同時分離檢測。利用HPLC測定有機酸大多是關于發酵產品［13］、食品［14］、飲料［15］等，而利用高效液相色譜對飼料添加劑中的甲酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丙酸、苯甲酸含量的同時測定方法鮮見報道。本研究在大量試驗基礎上，建立了飼料添加劑中6種有機酸的高效液相色譜同時測定的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Alliance 2695高效液相色譜儀，2487紫外檢測器，ENPOWER色譜管理系統：美國 Waters公司；KQ5200B型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

甲酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丙酸、苯甲酸對照品：美國Sigma-Aldrich公司；鹽酸（優級純）：四川西隴化工有限公司；乙腈 （色譜純）：美國Fisher公司；水為Milli-Q Gradient超純水。

飼料酸化劑樣品：市售。

1.2 標準溶液和提取溶液的配制

精密稱取甲酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丙酸對照品各1.000 0 g，置100 mL棕色量瓶中，加鹽酸溶液（0.1%）適量溶解后稀釋至刻度，分別得到濃度為10 mg／mL的儲備液；準確稱取苯甲酸對照品約0.040 0 g，置于100 mL棕色量瓶中，加鹽酸溶液（0.1%）∶乙腈（1∶1）適量溶解后稀釋至刻度，得到濃度為0.4 mg／mL的儲備液。根據需要稀釋成系列標準溶液。

1.3 HPLC分析條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18色譜柱，150×4.6 mm，5μm；流速：0.8 mL／min；柱溫：30℃；檢測器：紫外檢測器，波長為210 nm；進樣體積：20μL。流動相A：乙腈，流動相B：鹽酸溶液（0.1%）；梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.4 供試樣品溶液的制備

稱取0.5 g（精確至0.000 1 g）酸化劑于100 mL的棕色容量瓶中，加入鹽酸溶液（0.1%）∶乙腈（1∶1）適量，超聲溶解20 min，定容至刻度，取上清液經微孔膜（0.22μm）過濾，濾液供HPLC分析。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

采用Waters2695高效液相色譜儀，比較了常規C18柱和SB-C18柱對6種有機酸的分離效果，發現常規C18柱不能很好地分離乳酸和乙酸，而使用SB-C18（適用于較低pH值的流動相）柱可取得了良好的分離效果，6種有機酸標準譜圖見圖1。

圖1 6種有機酸的標準溶液色譜圖

在反相色譜分離過程中，有機酸分子直接在兩相中分配，各種有機酸因分配系數不同而被分離。為使有機酸盡可能以分子形式存在，一般使用酸性流動相來抑制有機酸的解離，本試驗以鹽酸溶液和磷酸溶液為流動相做比較，發現磷酸溶液為流動相時，峰形拖尾，而以0.1%的鹽酸為流動相峰形對稱。

另外還考察了流速分別為 0.6、0.7、0.8、1.0 mL／min時對各有機酸分離的影響，發現流速為1.0 mL／min時乙酸和乳酸不能完全分離；當流速為0.6、0.7 mL／min時，5種有機酸全部出峰，但分析時間過長；流速為0.8 mL／min時，25 min內色譜分析完成，且各目標物質能得到完全分離。所以選擇流速為0.8 mL／min。

2.2 線性關系和檢出限

分別取一定量的甲酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丙酸、苯甲酸儲備液配制成甲酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丙酸濃度均為10、50、100、300、500、1 000μg／mL，苯甲酸濃度為 0.4、2、4、12、20、40μg／mL的系列標準工作溶液。按照2.1色譜條件進樣，以峰面積對濃度繪制標準曲線。以3倍信噪比計算檢出限，以10倍信噪比計算定量限，見表2。

表2 6種有機酸的回歸方程、檢出限和定量限

2.3 精密度、穩定性和回收率試驗

取標準工作溶液，按照1.3分析條件，連續進樣6次，甲酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丙酸、苯甲酸的保留時間RSD分別為0.02%、0.03%、0.02%、0.05%、0.02%、0.02%；峰面積RSD分別為0.12%、0.08%、0.15%、0.06%、0.30%、0.12%，說明儀器精密度良好。

取加標樣品溶液，在室溫下避光放置1、2、4、8 h后進樣，甲酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丙酸、苯甲酸峰面積的 RSD分別為 0.53%、0.81%、0.69%、0.97%、0.88%、0.52%。試驗結果表明，樣品溶液中6種有機酸在8 h內穩定，為保證測定結果的準確性，樣品制備后應立即上機測定。

為了研究方法的可靠性，取樣品0.5 g，添加2個濃度水平的標準溶液，每水平3個平行樣，按照1.4供試品溶液制備方法進行處理，按照1.3儀器條件進行測定，回收率結果見表3。結果顯示，6種有機酸的回收率為96.5%～103.2%，變異系數為0.94%～4.15%，符合試驗要求。

表3 6種有機酸的回收率和測定的相對標準偏差（n＝3）

2.4 酸化劑樣品的測定

對酸化劑樣品進行定性與定量測定，見表4。

表4 樣品的定量分析結果，n＝3）

表4 樣品的定量分析結果，n＝3）

樣品質量分數／%甲酸 乳酸 乙酸 檸檬酸 丙酸 苯甲酸1 15.0±1.32未檢出 未檢出 未檢出19.7±0.04 6.17±0.25 2 5.35±1.03 17.8±0.38未檢出 24.6±0.57未檢出 未檢出

3 結論

利用高效液相色譜法測定飼用酸化劑中有機酸的含量，方法簡便快速、重現性好、分離效果良好、靈敏度高、檢測結果可信度高，可以滿足飼用酸化劑中有機酸質量控制檢測需要。

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Simultaneous Determination of Six Kinds of Organic Acids in Feed Additives by High Performance Liquid Chromatography

Zhao Yan Zhang Fengping Yang Fashu Liu Yaomin

（Key Laboratory of Aquatic，Livestock，Poultry Nutrition and Healthy Culturing，Ministry of Agriculture，Tongwei Co.，Ltd.，Chengdu 610041）

A method was established for the simultaneous determination of formic acid，lactic acid，acetic acid，citric acid，propanoic acid and benzoic acid in feed additives by high performance liquid chromatography.Analytes were extracted with hydrochloric acid solution（0.1%）：acetonitrile（1∶1）.Separation and quantification were achieved by using a ZORBAX SB-C18 column，and a mobile phase of acetonitrile-hydrochloric acid solution（0.1%）was used for gradient elution.The detection wavelength was 210 nm.The external standard method was used for quantification.There was a good linear relationship for six organic acids（correlation coefficient is0.999 9）.Average spike recovery of six organic acids was 96.5%～103.2%，with variable coefficient of 0.94%～4.15%，the limit of detection for formic acid，lactic acid，acetic acid，citric acid，propanoic acid and benzoic acid being 0.1，1.0，1.0，0.5，0.5 and 0.02μg／mL respectively.This method is simple，sensitive，reproducible and suitable for the determination of six organic acids in feed additives.

high performance liquid chromatography，feed additives，organic acids

O657.7

A

1003-0174（2015）02-0127-04

四川省科技支撐計劃（2011NZ0071）

2013-10-14

趙艷，女，1983年出生，工程師，飼料營養及質量安全評價