鈦顆粒對OPG-RANKL-RANK 通路干預的時間依賴性研究

吳 垠 王 楊 勾旭升 劉立冰 趙承斌

近年來，人工髖關節置換已經成為關節外科的常規手術，隨著人工關節置換例數的增加及術后假體使用時間的延長，假體周圍骨溶解及人工關節的無菌性松動成為關節外科面臨的難題之一。關節翻修術是目前解決假體松動的主要方法，但卻面臨著手術難度高、效果差、費用昂貴等諸多不利因素。因此，如何提高假體使用年限，避免假體周圍骨溶解逐漸成為研究熱點。研究表明，假體在磨損過程中產生的金屬顆粒會刺激骨髓基質細胞活化，通過核因子-κB 受體活化因子配體(RANKL)激活破骨細胞表面表達的核因子-κB 受體活化因子(RANK)，進而促進破骨細胞增殖，介導假體周圍骨溶解［1，2］。本研究在體外培養的成骨細胞中加入鈦顆粒，在不同時間點檢測RANK的競爭性受體骨保護素(OPG)和RANKL 的表達水平，從而為治療假體周圍骨溶解提供一定的實驗依據。

材料與方法

1.實驗材料:MC3T3 -E1 細胞株購自美國ATCC 公司，鈦顆粒購自美國Zimmer 公司，DMEM 培養液購自美國HyClone公司，胎牛血清購自中國TBD 公司，Trizol 購自美國Invitrogen公司，PCR 試劑盒購自日本TaKaRa 公司，ELISA 試劑盒購自美國Invitrogen 公司。

2.實驗方法:(1)成骨細胞的培養與傳代:MC3T3 -E1 細胞復蘇后，加入DMEM 培養液5ml，1500r/min 離心5min，棄上清，反復3 次，去除殘留的二甲基亞砜，加入含有10%胎牛血清的DMEM 培養基5ml 重懸，移入培養瓶中，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中進行培養，每48h 進行更換培養液。待細胞鋪滿瓶底80%后，棄去培養液，加入0.25%胰酶1ml 消化30min，加入DMEM 培養液5ml 終止消化。移入離心管1500r/min 離心5min，棄上清。加入DMEM 培養液10ml，吹打混勻后移入兩個培養瓶中，每瓶5ml，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中繼續培養，連續傳5 代備用。(2)成骨細胞的分組:傳至第5 代的成骨細胞，細胞計數板計數后，調整細胞濃度為5 ×105/ml，分別移入4 個6 孔板中，每板為1 組，隨機標記為A、B、C、D 共4 組，每組各孔分別標記為1 ～6 號孔。各組1 ～3 號孔均加入含有0.1mg/L 鈦顆粒、10%胎牛血清的DMEM 培養基進行培養;各組4 ～6 號孔均單純加入10%胎牛血清的DMEM 培養基進行培養，作為陰性對照。A、B、C、D 4組分別于培養12、24、36 和48h 后進行real - time PCR 和ELISA 檢測OPG 和RANKL 的表達水平。(3)OPG 和RANKL蛋白表達的ELISA 檢測:A 組細胞于培養后12h 分別單獨提取A1 ～A6 號孔的培養液，根據ELISA 試劑盒說明，96 孔板中A1 ～A6 每種樣品均設2 個復孔，進行加樣，每孔100μl。封板紙粘貼后，37℃放置60min，洗板后相繼加入抗OPG 或RANKL 的一抗工作液、酶標抗體工作液，而后終止反應，在450nm 處測定吸光度(A)值，取A1 ～A3 3 組平均A 值與A4～A6 3 組平均A 值進行比較。與A 組步驟相同，B、C、D 組也分別在24、36 和48h 進行ELISA 檢測。(4)OPG 和RANKL mRNA 表達的real-time PCR 檢測:A 組細胞在培養12h 提取培養液進行ELISA 檢測后，將剩余貼壁的成骨細胞用PBS 液沖洗3 次，每孔加入0. 25% 胰酶0. 5ml 消化30min，加入DMEM 培養液終止消化。分別單獨提取A1 ～A6 號孔細胞，放入去RNA 酶的EP 管中，1500 r/min 離心5min，棄上清，-80℃凍存后加入1ml Trizol 提取總RNA，經沉淀、清洗后根據TARAKA 公司的PCR 試劑盒說明反轉錄合成cDNA。向real-time PCR 反應體系中加入上下游引物各0.5μl (表1)，cDNA 模板2μl，ddH2O 8.25μl，熒光染料1.25μl，Taq 聚合酶1μl等，以GAPDH 為內參。反應條件為:RANKL 94℃變性5min，94℃30s，56℃復性30s，72℃延伸30s，擴增33 個循環;OPG 和GAPDH 均為94℃變性5min，94℃30s，55℃復性30s，72℃延伸30s，擴增33 個循環。根據PCR 儀給出的Ct 值，計算樣本ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt =ΔCt實驗組-ΔCt對照組，應用公式2-ΔΔCt計算OPG 及RANKL 的相對量。與A 組步驟相同，B、C、D 組也分別在24、36 和48h 進行real-time PCR 檢測。

表1 實時定量PCR 的引物序列

3.統計學方法:采用SPSS 18.0 統計學軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間樣本比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK -q 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.成骨細胞的培養與傳代:復蘇后的成骨細胞在倒置顯微鏡下可見細胞呈圓球形，折光性強，散在漂浮于培養液中，6h 后逐漸沉降貼壁，24h 后貼壁細胞完全展開，呈多邊形、三角形等不規則形態。細胞約72h 鋪滿瓶底的80%，進行傳代后，細胞生長良好，連續傳5 代，細胞形態穩定，未見異常核分裂象。A、B、C、D 4 組1 ～3 孔接種鈦顆粒后，可見鈦顆粒平均分布于成骨細胞周圍，多數被成骨細胞所吞噬。

2.OPG 和RANKL 蛋白表達的ELISA 檢測:A、B、C、D 4 組細胞分別在12、24、36 和48h 終止干預，并收集細胞外液進行ELISA 檢測，測得數值減去零孔值后得到OPG 及RANKL 蛋白A 值見表2?？梢娂尤脞侇w粒后12h，培養液中OPG 及RANKL與對照組相比，差異無統計學意義(P ＞0.05);24 ～48h，OPG 含量逐漸減少，與對照組相比差異有統計學意義(P ＜0.05)，與此同時，RANKL 蛋白含量逐漸增多，與對照組相比差異有統計學意義(P ＜0.05)。

表2 OPG 和RANKL 蛋白平均吸光度(±s)

表2 OPG 和RANKL 蛋白平均吸光度(±s)

與對照組相比，* P ＜0.05

分組12h 24h 36h 48h OPG 實驗組 10.33±2.44 8.96±2.02* 7.84±1.30* 7.66±0.63*OPG 對照組 11.07±1.77 9.76±0.51 10.06±1.77 9.63±1.11 RANKL 實驗組 6.04±1.60 7.51±0.57* 8.91±0.59* 10.94±0.58*RANKL 對照組5.56±0.97 5.83±0.24 6.13±0.39 6.42±0.23

3. OPG 和RANKL 的mRNA 表達的real - time PCR 檢測:A、B、C、D 4 組細胞分別在12、24、36 和48h 終止干預，并收集細胞提取RNA，經反轉錄后進行RT-PCR 檢測。RT -PCR 產物測序結果與基因庫中OPG 和RANKL 的序列吻合，證明RT -PCR 產物為小鼠OPG 和RANKL 的基因序列。各樣本OPG、RANKL 及GAPDH 的mRNA 均明確表達，根據所測得Ct 值計算2-ΔΔCt值得到mRNA 相對表達量，結果見表3?？梢奜PG mRNA 的表達在12h 后即開始降低，且持續下降至48h，與對照組相比，差異有統計學意義(P ＜0.05)。RANKL mRNA 的表達與OPG 相反，在12h 后即開始升高，且持續升高至36h 后趨于穩定，與對照組相比，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

表3 OPG 和RANKL 的mRNA 相對表達量(±s)

表3 OPG 和RANKL 的mRNA 相對表達量(±s)

與對照組相比，* P ＜0.05

分組12h 24h 36h 48h OPG實驗組 0.89±0.07* 0.81±0.11* 0.74±0.15* 0.72±0.16*對照組 1.00±0.14 1.00±0.13 1.00±0.16 1.00±0.13 RANKL實驗組 1.21±0.21* 1.22±0.33* 1.24±0.09* 1.24±0.04*對照組1.00±0.06 1.00±0.03 1.00±0.12 1.00±0.16

4. RANKL/OPG 比值的變化:根據不同時間點RANKL、OPG 在蛋白水平和RNA 水平的測量值，計算RANKL/OPG 的比值，結果見圖1 及圖2。在12h時兩組比值差異無統計學意義(P ＞0.05)，而后實驗組比值升高，在24、36 及48h 均高于對照組(P ＜0.05)，說明骨分解代謝增強。由圖2 可見，由于real-time PCR 以對照組為參照計算的特點，對照組呈一直線，實驗組RANKL/OPG 比值增高趨勢，且以24～36h 最為活躍。

討 論

圖1 蛋白水平的RANKL/OPG 比值變化

圖2 mRNA 水平的RANKL/OPG 比值變化

人工髖關節置換是治療股骨頭壞死最為有效的方案，隨著幾年來人工髖關節置換手術適應證的增多，人工髖關節置換已經成為關節外科的常規手術。然而，髖關節置換術后假體無菌性松動和假體周圍骨溶解卻成為術后遠期棘手的并發癥，一旦出現假體松動，就需要進行關節翻修術，其手術難度大、風險高、費用昂貴［3］。如何防止置換術后假體松動也隨之成為關節外科的研究重點。近年來，國內外研究者發現，RANKL-RANK-OPG 信號轉導通路是影響關節置換術后假體松動的重要原因［4，5］。

關節置換術后，隨著關節的運動摩擦，會有微小的金屬假體顆粒脫落，在關節周圍刺激炎性細胞增生，釋放多種細胞因子，刺激骨髓基質細胞及成骨細胞活化，產生RANKL 蛋白［6］。RANKL 蛋白與破骨細胞表面的跨膜蛋白RANK 結合，進而通過NF -κB途徑向破骨細胞內信號轉導，導致破骨細胞大量增殖，從而破壞關節周圍骨質，導致假體植入術后骨溶解及假體無菌性松動［7］。RANKL 主要存在于骨髓基質細胞和成骨細胞中，是腫瘤壞死因子(TNF)配體家族的成員，以跨膜蛋白、可溶性蛋白和全鏈分泌式蛋白3 種形式存在，受IL -1、IL -17、糖皮質激素等多種因子刺激而表達，作用于其受體RANK［8］。RANK首先于樹突細胞中被發現，屬TNF 受體家族成員，其在進化中序列高度保守，多跨膜存在于免疫細胞及破骨前體細胞表面［9，10］。當破骨細胞表面RANK 與RANKL 結合后，即會使破骨前體細胞向破骨細胞轉化，促進骨溶解［11］。正常生理狀態下，成骨細胞和破骨細胞之間存在著動態平衡，以保證骨骼的生長代謝，這一過程即依靠OPG 進行調節［12］。OPG 是成骨細胞分泌的可溶性蛋白，能夠與RANK 競爭性結合RANKL 的結合位點，從而減輕破骨作用［13，14］。OPG是成骨細胞自身分泌的負反饋調節作用，主要受RANKL 濃度影響，RANKL 與OPG 的比例在骨代謝過程中起著極為重要的作用［15，16］。

本研究發現，在鈦顆粒作用于成骨細胞之后，RANKL 基因的mRNA 表達水平迅速升高，維持在較高水平，在實驗時間內，未見其有下降趨勢。與此同時，OPG 基因的mRNA 表達水平在逐漸下降，并維持在相對較低水平，并沒有因RANKL 的表達水平增高而負反饋調節性增高，因此說明了金屬鈦顆粒既能夠促進RANKL 的表達水平增高，又能夠抑制OPG 的負反饋作用。鈦顆粒的雙重作用使得RANKL/OPG 的比值升高，導致破骨細胞的作用強于成骨細胞的作用，加速骨溶解。鈦顆粒作用12h 后，RANKL 和OPG的mRNA 表達均開始升高，而培養液中蛋白含量與對照組相比無明顯差異，可能是由于轉錄后的翻譯過程 需 要 時 間 所 致［17，18］。在 不 同 時 間 點 對 各 組RANKL mRNA 含量進行單因素方差分析，整體差異有統計學意義(P ＜0.05)，經SNK -q 檢驗后，36h 和48h 之間沒有差別，說明鈦顆粒的作用達到穩定，而在24h 前后，mRNA 上升最為明顯。與之對應，24h時OPG 的下降最為明顯，說明了鈦顆粒的主要作用在12 ～24h 之間。但與體外實驗不同，關節假體會隨著使用強度、使用時間的不同出現不同程度的磨損，因此鈦顆粒的濃度也不盡相同，不可控因素較多，尚需進一步研究［19，20］。

綜上所述，關節假體產生的鈦顆粒既能夠上調RANKL 的表達水平，又會抑制OPG 的形成，從而加速假體周圍的骨溶解作用。

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