弗氏完全佐劑致大鼠急性膝關節炎動物模型制備

陳德森 李 莉 吳勝英 彭吉霞 李賢玉

急性膝關節炎動物模型是基礎藥理學及臨床疼痛研究較常用的實驗模型［1］。以往常采用醋酸皮下注射法復制急性膝關節炎動物模型，本實驗采用弗氏完全佐劑法復制膝關節炎動物模型，其病理形態及病理生理學改變與臨床膝關節炎甚為相似，具有相似度極高的臨床及生化檢驗特點，現就該動物模型制作介紹如下［2］。

材料與方法

1.實驗動物:SPF 級Wistar 大鼠30 只，雌雄兼用，體質量180 ～250 g，由湖北省實驗動物研究中心提供［SCXK(鄂)2011 -008］，飼養于屏障設施［SYXK(鄂)2011 -0031］。

2.藥品與試劑:生理鹽水、醋酸、弗氏完全佐劑(上海實生細胞生物技術有限公司)。

3.急性膝關節炎模型制備:采用數字表法將大鼠隨機分為3 組(n=10):對照組、醋酸組、佐劑組。碘伏浸泡大鼠右足趾消毒，采用日本鬼頭康彥的造摸方法，將弗氏完全佐劑0.5ml 注人右膝關節腔內，于第1、3、7 天各注射1 次［3］。根據臨床上超疲勞容易提前出現骨關節炎的發病特點，每日強迫動物活動30min，14 天后出現以下與臨床急性膝關節炎表現一致的癥狀即可確定大鼠急性膝關節炎模型造模成功:①關節及其周圍僵硬、活動受限;②關節出現紅、腫、熱、痛、同時軟組織腫脹或積液;③發病的部位常見于膝、髖、踝等關節處;④關節積液檢查出現IL-1β 降低，HA 含量明顯升高;⑤關節病理切片鏡檢出現關節腔大量滲出液，軟骨表面粗糙，滑膜增生、粘連、肥厚等膝關節炎臨床病理學改變。對照組注射等量生理鹽水作對照，醋酸組注射97%醋酸0.5ml。注射后創口碘伏浸泡消毒1 周(每日1 次)以預防感染。參照文獻［4］于造模后7、14 天分別抽取膝關節腔積液測定積液白細胞介素-1β(IL-1β)、透明質酸(HA)含量。

4.動物一般狀況觀察:動物的一般狀況觀察(包括自潔情況、攝食、飲水量、活動等)，存活情況。

5.膝關節腫脹百分率的測定:于造模前及造模后7、14 天用玻璃容器排水法測量:先取直徑2cm 的30ml 量筒注入蒸餾水，液面與量筒最高處平齊，用10ml 注射器吸取量筒內蒸餾水約5ml。于每只大鼠右膝關節做一標記，然后把大鼠右足跖緩慢伸人量筒內，使標記與量筒最高處平齊。再用已吸入5ml水的注射器向量筒內緩慢注入蒸餾水并使液面再次與最高處及大鼠膝關節標記一致，讀取注射器內剩余液體體積，即為大鼠的膝關節體積，重復3 次取平均值。并計算膝關節腫脹百公率:膝關節腫脹百分率(%)= (造模后容積- 造模前容積)/造模前容積×100%。

6.組織形態學檢查:14 天后處死大鼠，迅速取各組動物膝關節滑膜標本用10%中性甲醛固定，1 周后常規脫水，石臘包埋，切片經HE 染色，光鏡下觀察組織形態。

7.統計學方法:采用SPSS 13.0 軟件進行統計分析，實驗數據以均數±標準差(±s)表示，指標的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間差異則采用Dunnett 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.大鼠一般情況的變化:對照組造模前及造模后7、14 天觀察，大鼠體毛有光澤，反應敏捷，飲食正常，無死亡。醋酸組大鼠1 周后精神及自潔情況差，大鼠體毛發無光澤，醋酸刺激性太強引起動物劇痛舔足，關節腫脹，卷縮，拒絕活動，攝食及飲水量減少，無死亡，8 只大鼠造模成功，模型成功率為80%。佐儕組大鼠1 周后精神及自潔情況較醋酸組稍好，部分大鼠體毛無光澤，關節及其周圍僵硬、活動受限，舔足，攝食及飲水量與正常大鼠無明顯差別，無死亡，10 只大鼠均造模成功，模型成功率為100%。

2.膝關節積液中IL-1β、HA 含量:由表1 可見，對照組IL -1β、HA 無明顯變化;醋酸組在造模后7天時測得IL-1β 小幅度升高、HA 含量有降低趨勢，第14 天IL-1β 明顯高于、HA 含量低于對照組(P ＜0.05);佐儕組在造模后7 天時IL-1β 即開始明顯升高，HA 含量明顯降低，第14 天測得IL-1β 升高達峰值、HA 含量大幅降低，與術前及醋酸組比較差異具有統計學意義(P ＜0.05)，說明弗氏完全佐劑能在更短時間促使炎性介質IL -1β 大量分泌釋放，抑制關節保護介質HA 的分泌，破壞HA 對關節面的保護屏障而造成膝關節炎性反應。弗氏完全佐劑組生化測定與臨床相符度高，表明弗氏完全佐劑能更好的復制急性膝關節炎。

表1 大鼠造模前及術后膝關節腔內IL-1β 及HA 含量的變化(±s，n=10)

表1 大鼠造模前及術后膝關節腔內IL-1β 及HA 含量的變化(±s，n=10)

與對照組比較，* P ＜0.05;與造模前比較，#P ＜0.05;與醋酸組比較，ΔP ＜0.05

組別 IL-1β(ng/ml)HA(mg/L)造模前 術后7 天 術后14 天 造模前 術后7 天 術后14天2.07 ±0.04 2.07 ±0.03醋酸組 19.19 ±0.25 24.94 ±0.27 25.54 ±0.37* 1.91 ±0.01 1.77 ±0.05 1.04 ±0.02*佐儕組 20.04 ±0.31 34.57 ±0.41* #Δ 41.47 ±0.48* #Δ 1.97 ±0.05 0.94 ±0.02* #Δ 0.73 ±0.01* #Δ對照組 18.32 ±0.24 17.91 ±0.24 18.23 ±0.23 2.01 ±0.05

3.膝關節腫脹百分率對比情況:對照組在造模后第7、14 天后關節無腫脹現象;醋酸組及佐劑組膝關節均出現不同程度的腫脹，醋酸組第7、14 天后關節腫脹百分率分別為22. 07% ± 0. 05%、21. 97% ±0.24%;佐劑組分別為36.21% ±4.71%、39.34% ±3.98%;數據顯示佐劑組關節腫脹百分率高于醋酸組，其炎性反應更加明顯(P ＜0.05)，說明弗氏完全佐劑復制急性膝關節炎動物模型更為成功(表2)。

表2 大鼠造模前及術后膝關節腫脹百分率(%)對比(±s，n=10)

表2 大鼠造模前及術后膝關節腫脹百分率(%)對比(±s，n=10)

與對照組比較，* P ＜0.05;與造模前比較，#P ＜0.05;與醋酸組比較，ΔP ＜0.05

項目 造模前術后7 天 14天0.02 ±0.00 -0.01 ±0.00 0.01 ±0.01醋酸組 -0.01 ±0.01 22.07 ±0.05* 21.97 ±0.24*佐儕組 0.01 ±0.00 36.21 ±4.71* #Δ 39.34 ±3.98* #Δ對照組

4.膝關節滑膜病理切片組織形態學檢查:對照組(圖1A)組織結構正常，無充血、水腫和中性粒細胞浸潤。醋酸組(圖1B)滑膜呈現充血、水腫和中性粒細胞浸潤。而佐劑組(圖1C)關節軟骨表面粗糙，變暗呈灰黃色，并有裂紋、糜爛及潰瘍形成;滑膜存在不同程度增生、粘連;關節液量增多，且呈泡沫狀，滑膜血管擴張，血漿和細胞外滲，產生大量滲出液，滑膜肥厚、關節內粘連和淋巴細胞和漿細胞浸潤;軟骨細胞排列不規則，基質分布不均，表明弗氏完全佐劑致膝關節炎性反炎更為明顯。

圖1 14 天大鼠膝關節滑膜組織病理形態觀察(HE，×40)

討 論

膝蓋滑膜炎又稱膝關節滑膜炎，是一種多發性疾?。?，6］。當膝蓋滑膜損傷后，關節腔滑膜血管擴張、充血、水腫及大量中性粒細胞浸潤，造成關節腫脹及活動受限［7］。如不及時處理，會導致滑膜絨毛水腫、結締組織纖維增生老化，造成滑膜組織再生及修復能力降低，嚴重者出現滑膜肥厚、關節粘連和軟骨變性等病理改變，嚴重影響患者活動。故對膝關節滑膜炎的早期診治顯得尤為重要。本研究的目的就是為尋找一種病理形態及病理生理學改變與臨床膝關節炎高度相似的動物模型用于研究膝關節滑膜炎。

關節炎的病理變化主要為軟骨的破壞與變性，以及繼發的滑膜與滑液炎性改變，是軟骨分解與合成代謝失衡的結果。正常的關節滑液中僅含有微量的IL-1β，但在膝關節炎關節液中IL -1β 的含量則異常增高［8］。IL-1β 作為重要的炎性介質，具有細胞破壞能力。王慶甫等［9］證明關節軟骨的破壞主要是由IL-1β 激發的。HA 是由D -葡萄糖醛酸和N -乙酰氨基葡萄糖胺二糖單位有規律重復構成的大分子鏈狀多糖，化學本質為糖胺多糖，廣泛分布于人及動物的結締組織、眼玻璃體和滑液中，是關節滑液和軟骨基質的重要組成部分，黏附于關節軟骨表面，形成保護屏障，調整滑膜通透性，減低摩擦系數潤滑關節腔，營養關節軟骨，利于關節軟骨修復［10］。

本研究發現，醋酸組在造模后第14 天測得IL -1β 明顯升高、HA 含量降低，說明炎性介質分泌較晚;而弗氏完全佐劑組在造模后7 天即開始明顯升高，HA 含量明顯降低，第14 天測得IL-1β 升高達峰值、HA 含量顯著降低，與醋酸組比較差異有統計學意義，說明弗氏完全佐劑能在更短時間內促使炎性介質IL-1β 大量分泌，抑制關節保護介質HA 的分泌，破壞HA 對關節面的保護屏障而造成膝關節炎性反應。在造模后第7、14 天時觀察發現，醋酸組及弗氏完全佐劑均發生關節腫脹，但弗氏完全佐劑組膝關節炎性反應更明顯，第7、14 天兩次測得膝關節腫脹百分率明顯大于醋酸組，其模型成功率達100%，明顯優于醋酸組的80%。

在膝關節滑膜病理切片組織形態學檢查中發現，弗氏完全佐劑組病理學改變較醋酸組更為嚴重，出現典型的膝關節炎臨床病理學改變，如關節軟骨細胞排列不規則，基質分布不均;關節表面粗糙，伴有裂紋、糜爛及潰瘍形成;滑膜存在不同程度增生、粘連;關節腔大量滲出積液并呈泡沫狀，滑膜肥厚、關節內粘連和淋巴細胞和漿細胞浸潤等病理改變。目前急性膝關節炎動物模型大多采用關節腔注射醋酸法，但其缺點是醋酸刺激性太強，會引起動物劇痛，不太符合實驗動物倫理及動物福利規范，且其IL-1β、HA 分泌釋放改變比弗氏完全佐劑法出現的晚，病理改變亦不如弗氏完全佐劑典型［11］。本實驗研究證實，大鼠膝關節腔內注射弗氏完全佐劑第7 天后IL -1β 釋放即明顯升高、HA 顯著降低，具有典型的膝關節炎臨床病理學改變，且這種病理改變較醋酸組更為明顯，模型成功率高，IL-1β、HA 分泌改變出現早，動物疼痛幅度低，更符合實驗動物倫理及動物福利規范要求，不失為一種較理想可靠的急性膝關節炎動物模型造模方法［12］。

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