嗜酸乳桿菌培養物對斷奶仔豬腸道發育及消化酶活性的影響

■劉 陽 熊 昊 游金明 賀 琴

（江西農業大學動物科學技術學院，江西南昌 330045）

1 材料與方法

1.1 試驗材料

發酵豆粕（勃樂蛋白）和嗜酸乳桿菌培養物（酸酸乳）由上海源耀生物股份有限公司提供。發酵豆粕和嗜酸乳桿菌培養物的理化指標見表1、表2。

表1 發酵豆粕的理化指標(%)

表2 嗜酸乳桿菌培養物的理化指標

發酵豆粕（勃樂蛋白）是上海源耀生物股份有限公司的第三代發酵豆粕，采用單一原料豆粕，分別接種好氧微生物（1株枯草芽孢桿菌）和厭氧微生物（2株乳酸菌和1株酵母菌），采用特有設備，分別進行全程可控的好氧和厭氧兩次獨立發酵相結合的方式，深度降解豆粕中的熱穩定性抗營養因子（抗原蛋白和不良寡糖等），同時產生豐富的代謝產物，成品具有濃郁的發酵香味。

嗜酸乳桿菌培養物（酸酸乳）是上海源耀生物股份有限公司經過4年的精心研究和反復試驗論證，以高蛋白豆粕、奶粉、碳水化合物等為主要發酵底物，采用從健康仔豬腸道中分離獲得的嗜酸乳桿菌(菌株保藏號：CGMCC 8043)作為發酵菌株，經過96 h的深度半液態發酵，得到一種具有高度抑制大腸桿菌的功能性優質蛋白原料。

1.2 試驗動物與分組設計

選用遺傳背景、胎次和體重相近的21日齡斷奶仔豬48頭，隨機分為4個處理（對照組、試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組、試驗Ⅲ組），每個處理3個重復，每個重復4頭仔豬。

1.3 試驗飼糧

對照組仔豬飼喂玉米-豆粕型基礎飼糧。試驗Ⅰ組仔豬飼喂市場反映優良的奶粉飼糧（由某公司提供），試驗Ⅱ組仔豬飼喂用FSBM代替10.0%普通豆粕的試驗飼糧，試驗Ⅲ組飼糧是在試驗Ⅱ組基礎上用嗜酸乳桿菌培養物代替3.0%原有原料。飼糧配方參照NRC（2012）和我國豬飼養標準（2004）配制，飼糧組成及營養水平見表3。

1.4 飼養管理

試驗在江西農業大學實驗動物養殖基地進行，試驗豬在保育床上飼養，舍溫控制在25～27℃。自由采食和飲水，飼糧為粉料。飼養管理參照本品種豬的飼養管理規程進行，試驗期21 d。仔豬免疫按常規程序執行。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 小腸形態結構

INCI中文名稱：蒙脫土，英文名Montmorillontie，CAS號：1318-93-0，又名微晶高嶺石，是一種層狀結構、片狀結晶的硅酸鹽粘土礦，成分一般為（Na,Ca）0.33（Al,Mg）2（Si4O10）（OH）2·nH2O，單斜晶系，通常為土狀塊體。白色，有時微帶紅色或綠色，光澤暗淡，是膨潤土和漂白土的主要成分。

在試驗第7、14、21 d從每個重復組中隨機選1頭仔豬進行屠宰。打開腹腔，分別剪取仔豬十二指腸、空腸、回腸中段3 cm，用生理鹽水洗去食糜后置于10%中性甲醛溶液中固定，經常規酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、攤片、貼片、常規蘇木精-伊紅（HE）染色制成5 μm石蠟切片，采用江南BM 2000光學顯微鏡觀察并拍照，Image Pro Plus 6.0軟件雙盲法讀片測量各樣本的絨毛高度（Villus Length，V是腸腺開口到絨毛頂端的垂直高度）和隱窩深度（Crypt Depth，C絨毛根部上皮凹陷到固有層的距離），每張切片觀察拍照5個視野,并計算（V/C）。

表3 飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.5.2 小腸上皮超微結構

取35日齡、42日齡仔豬空腸腸段約2 cm，按照孫云子方法將腸組織樣在冰上用刀片修成大約1×1×1 mm3大小，用牙簽輕輕挑出修整好的樣品移至盛有預冷2.5%戊二醛固定液的2 ml的EP管中進行前固定，PBS磷酸緩沖液沖洗三次，1%鋨酸后固定，PBS磷酸緩沖液沖洗三次，梯度酒精脫水（50%、70%、80%、95%、100%兩次）每次15 min。純丙酮脫水兩次（15 min），EPON 812∶丙酮（1∶1）浸透30 min，純包埋液浸透1 h，純包埋液固化37℃24 h后60℃48 h。使用超薄切片機切片（BROMMA LKB-V），經醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛雙重染色后用日立H-600透射電鏡觀察并拍照。

1.5.3 空腸黏膜二糖酶活性

于試驗第7、14、21 d進行屠宰取樣，從每個重復組中選取1頭體重接近仔豬，屠宰。參考Arne Dahlqvist方法制備黏膜勻漿液，即仔豬屠宰后立即取空腸15 cm，輕輕擠出腸內容物，用4℃去離子水小心沖洗后，縱向剪開腸壁，并展開于遇冷的表面皿上。經濾紙吸水，用載玻片小心刮取小腸黏膜，分裝在2 ml無菌凍存管中，立即放入液氮中速凍，再轉入-80℃低溫冰箱中凍存。

準確稱取一定質量的空腸黏膜，按1∶9質量體積比加入PBS溶液，冰浴勻漿后，在4℃條件下3 000×g離心10 min。分離上清液，即為10%的小腸黏膜勻漿液。采用試劑盒（購自南京建成）測定二糖酶（蔗糖酶、乳糖酶、麥芽糖酶）、Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶活性。

1.6 數據處理與統計分析

試驗數據經Excel進行初步處理后，采用SPSS 17.0軟件進行統計。以重復為單位，以P＜0.05為顯著性判斷標準。各處理數據以“平均數±標準差”表示，并分析比較嗜酸乳桿菌培養物對腸道形態結構、空腸二糖酶活性的影響差異。

2 結果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌培養物對斷奶仔豬小腸絨毛形態結構的影響(見表4)

表4 嗜酸乳桿菌培養物對斷奶仔豬小腸絨毛形態結構的影響

表4數據顯示，28日齡時，試驗Ⅰ組空腸絨毛高達378.56 μm顯著高于對照組339.79 μm（P＜0.05）；試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的空腸V/C顯著高于對照組（P＜0.05）。在飼糧中添加FSBM、嗜酸乳桿菌對仔豬的十二指腸、回腸絨毛高度和V/C無顯著影響（P＞0.05），并對仔豬各腸道的隱窩深度也無顯著影響（P＞0.05）。

35日齡時，試驗組仔豬各段絨毛高度均有所提高，其中試驗Ⅲ組的效果最好，試驗Ⅲ組空腸絨毛高達378.66 μm，與對照組相比顯著增長15.49%，效果最佳，也顯著高于試驗Ⅱ組（P＜0.05），并且試驗Ⅱ組仔豬十二指腸、回腸的絨毛高度顯著高于對照組（P＜0.05）。試驗組的仔豬十二指腸、空腸隱窩深度顯著低于對照組（P＜0.05），且試驗Ⅲ組空腸隱窩深度186.17 μm，比對照組低9.04%，且均顯著低于其他組。試驗Ⅰ組、試驗Ⅲ組回腸隱窩深度顯著低于對照組（P＜0.05）。試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組十二指腸、空腸、回腸的V/C都顯著高于對照組（P＜0.05）；試驗Ⅲ組空腸和回腸的V/C都顯著高于試驗Ⅱ組（P＜0.05）?？梢婏暳现刑砑覨SBM可促進斷奶仔豬腸道發育，并且用嗜酸乳桿菌培養物替代原有原料3%后效果更好，在飼料中同時添加FSBM和嗜酸乳桿菌培養物與奶粉飼糧的效果相當。

42日齡時，與對照組相比，試驗Ⅰ組和試驗Ⅲ組的仔豬十二指腸絨毛高度顯著升高，隱窩深度顯著降低（P＜0.05）。試驗Ⅰ組的仔豬空腸絨毛高度達369.58 μm，顯著高于對照組和試驗Ⅱ組；試驗Ⅲ組空腸絨毛高度達360.04 μm，也顯著高于對照組。試驗Ⅲ組空腸隱窩深度與對照組相比顯著降低（P＜0.05）。與對照組相比，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組的仔豬十二指腸、空腸V/C均顯著升高（P＜0.05），并且試驗Ⅰ組十二指腸的V/C高達2.22，與對照組相比升高了15.63%。

2.2 嗜酸乳桿菌培養物對斷奶仔豬空腸上皮超微結構的影響(見圖1)

由圖1可看出，對照組微絨毛比較稀疏，疏密不等，部分絨毛存在脫落和損傷跡象。飼糧中添加FSBM后仔豬空腸上皮微絨毛相對密集、整齊，并在添加FSBM的基礎上再添加嗜酸乳桿菌培養物仔豬空腸微絨毛更纖細、密集。奶粉飼糧組的仔豬空腸微絨毛更密集、整齊、纖細于對照組。

2.3 嗜酸乳桿菌培養物對斷奶仔豬空腸黏膜消化酶活性的影響(見表5)

從表5數據可知，28日齡時，試驗Ⅲ組仔豬空腸蔗糖酶活性達53.96 U/mg prot，顯著高于對照組（33.08 U/mg prot）（P＜0.05），但與試驗Ⅰ、Ⅱ組相比差異不顯著（P＞0.05）。試驗Ⅰ組仔豬空腸蔗糖酶活性較高，也顯著高于對照組仔豬空腸蔗糖酶活性（P＜0.05）。在35日齡時，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的蔗糖酶活分別性達99.87、89.60、95.89 U/mg prot，與對照組相比均顯著升高（P＜0.05）。42日齡時，仔豬空腸蔗糖酶活性與28日齡、35日齡時相比均獲得提高；試驗Ⅲ組仔豬空腸蔗糖酶活性達141.78 U/mg prot，顯著高于對照組(104.20 U/mg prot)?？梢婏暳现刑砑覨SBM可提高仔豬空腸蔗糖酶活性，并用嗜酸乳桿菌培養物替代原有原料3%后的效果更好。

仔豬在28日齡時，試驗Ⅰ、Ⅲ組的空腸乳糖酶活性顯著高于對照組（P＜0.05），且試驗Ⅰ組的空腸乳糖酶活性達到216.29 U/mg prot，該數據接近對照組122.44 U/mg prot的2倍，試驗Ⅲ組仔豬空腸乳糖酶活性達193.08 U/mg prot，與對照組相比顯著升高了57.7%（P＜0.05）。35、42日齡時，試驗Ⅲ組仔豬空腸乳糖酶活性均顯著高于對照組（P＜0.05）。

由表中數據可得出，添加FSBM和嗜酸乳桿菌對28日齡仔豬空腸麥芽糖酶活性無顯著影響，試驗Ⅱ、Ⅲ組空腸麥芽糖酶活性水平分別達到201.47 U/mg prot、199.31 U/mg prot，與對照組相比提高29.5%、28.2%。在35日齡時，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組空腸麥芽糖酶活性顯著高于對照組（P＜0.05）。42日齡時，試驗Ⅱ、Ⅲ組的空腸麥芽糖酶活性顯著高于對照組和試驗Ⅰ組（P＜0.05），且試驗Ⅲ組的最高。本試驗對仔豬空腸Na+/K+-ATP酶活性和Ca2+/Mg2+-ATP酶活性無顯著影響，但在28、35日齡時試驗組數據要高于對照組，并且試驗Ⅲ組最高。

3 討論

3.1 嗜酸乳桿菌培養物對斷奶仔豬腸道形態結構的影響

眾多研究表明，豆粕經發酵后，可大大提高營養價值，能去除多種抗營養因子，尤其是抗原蛋白水平,同時在發酵過程中產生大量益生菌、乳酸、小肽及游離氨基酸等物質,對幼齡動物的生長和胃腸發育具有促進作用(Feng等，2007；陳成等，2005；李文剛等，2005)。Kiers(2003)研究發現，飼喂FSBM可顯著改善仔豬的胃腸道發育。馮杰等研究發現，用FSBM代替普通豆粕可以減輕飼糧中大豆抗原蛋白對腸道的過敏損傷，能較好地維持腸道結構形態一致。本試驗結果顯示，飼喂FSBM的斷奶仔豬腸道絨毛高度、隱窩深度及V/C均有不同程度的改善，能夠較好地保護斷奶仔豬腸道形態結構，且在35日齡的效果最好，這與上述研究結果一致。

圖1 仔豬空腸橫切透射電鏡圖(×6 000)

有研究報道，微生態制劑添加于畜禽日糧中能夠產生對動物生長有益的有機酸、小肽和必需的維生素；改善動物腸道發育和促進動物健康，提高動物機體免疫功能等多種生理功能，從而達到提高動物生產性能及維護動物機體健康的目的。徐基利等發現，乳酸菌可提高畜禽腸道平均絨毛高度和隱窩深度。劉虎傳等在早期斷奶仔豬飼糧中添加益生菌研究發現可以緩解早期斷奶應激對絨毛高度和隱窩深度的影響。本試驗在用發酵豆粕代替的基礎上添加嗜酸乳桿菌對小腸絨毛高度、隱窩深度、V/C的統計發現，得到和上述一樣的結果，能有效地降低斷奶應激引起的腸道絨毛脫落，改善腸道結構完整性，促進小腸絨毛生長，抑制隱窩細胞增生。馬治宇等利用前期從肉雞盲腸中分離的一株嗜酸乳桿菌DL1株（LA-DL1）制成凍干粉劑，添加到蛋用雛雞飼料中也得出相似的結果。

表5 嗜酸乳桿菌培養物對斷奶仔豬空腸黏膜消化酶指標的影響（U/mg prot）

3.2 嗜酸乳桿菌培養物對斷奶仔豬上皮超微結構的影響

通過透射電鏡觀察發現結果與Kiers等(2003)、馮杰等(2007)、徐基利等(2011)、劉虎傳等(2012)研究一致，即日糧中添加FSBM和嗜酸乳桿菌能使仔豬空腸絨毛相對較整齊、粗長、密集。用FSBM替代普通豆粕可以改善仔豬小腸形態結構，促進仔豬腸道發育，并且在FSBM中添加嗜酸乳桿菌效果更佳。

3.3 嗜酸乳桿菌培養物對斷奶仔豬空腸黏膜消化酶活性的影響

小腸二糖酶是碳水化合物消化吸收至關重要的酶。假如消化道黏膜沒有二糖酶的存在，就沒有單糖的吸收、轉化和利用。故有學者建議將消化酶的發育作為小腸分化和衡量對飼糧適應的標準，現已成為研究熱點。麥芽糖酶、蔗糖酶和乳糖酶是3種最重要的二糖酶，分別將麥芽糖、蔗糖和乳糖分解成相應的單糖而被動物吸收利用(Siddons等，1972)。微生物發酵的過程可以降解大分子蛋白為小肽，有研究表明這些小肽能促進消化道發育，刺激消化酶的分泌與激活。研究表明，用微生物FSBM代替普通豆粕對小腸二糖酶活性有一定的影響。劉濟(2012)用FSBM代替普通豆粕飼喂AA肉雞后，試驗結果有顯著性差異，發現發酵豆粕能促進AA肉雞腸道消化酶的激活與分泌，提高消化酶活性。Kiers等(2000)研究發現，豆粕通過發酵使大豆內部結構發生生化反應導致其可溶性及消化率明顯得到提高。本研究斷奶仔豬日糧中用FSBM代替普通豆粕后發現，在28日齡時可顯著提高蔗糖酶活性，維持乳糖酶活性在較高水平，隨著日齡的增加乳糖酶活性逐漸降低。35、42日齡可顯著提高麥芽糖酶活性，并隨著日齡的增加呈上升的趨勢，這與Hartman等(1961)研究結果一致。

飼糧中添加3%的嗜酸乳桿菌培養物發現，仔豬空腸三種二糖酶活性都有所提高，這說明在飼糧中添加FSBM和嗜酸乳桿菌培養物能促進斷奶仔豬腸道消化功能的提早發育。

4 結論

①仔豬飼糧用FSBM代替10%普通豆粕可改善仔豬小腸形態結構，促進仔豬小腸黏膜發育。

②仔豬飼糧用FSBM代替10%普通豆粕可減弱斷奶應激引起的乳糖酶急劇下降，提高蔗糖酶、麥芽糖酶活性，但對仔豬空腸Na+/K+-ATP酶活性和Ca2+/Mg2+-ATP酶活性影響不大。

③在適當降低FSBM用量的同時，添加3%嗜酸乳桿菌培養物可以更好地改善仔豬腸道形態結構，提高消化酶活性，其效果與奶粉飼糧相當。

（參考文獻21篇，刊略，需者可函索）