鳀魚魚漿的酶解過程與營養成分的變化

■吳代武 稅典章 蔡春芳 吳 萍 葉元土 彭 侃 羅其剛 林秀秀

（蘇州大學基礎醫學與生物科學學院江蘇省水產動物營養重點實驗室，江蘇蘇州 215123）

鳀魚（Engraulis japonicus）是鳀屬魚類的統稱，鳀 屬魚類產量占世界水產品產量的10%～20%，在我國主要分布在黃海、東海海域[1]，是中國近海魚類中最大的魚類種群資源[2]。鳀魚營養價值較高，蛋白質含量約為15%～20%，必需氨基酸含量豐富[3]，具有較高的開發價值。

在魚粉資源日益緊張的情況下，開發新的飼用產品提高資源的利用效率也是對資源的一種節約。以新鮮的海水低值魚類為原料生產魚漿用于飼料，在實際生產中表現出很好的效果，主要特點是維護了原料魚的蛋白質和油脂新鮮度、保持了海水魚類原料對養殖動物生長的優勢，同時也增加了飼料的誘食效果、增加了飼料生產過程中的水分含量。傳統的魚粉生產工藝中，原料魚在蒸煮、烘干等生產環節經一定的高溫處理，使一些有害成分含量升高[4]。鳀魚體內肝胰臟、腸道和細胞溶酶體中含有豐富的內源蛋白酶[5-6]，能將自身蛋白質酶解成多肽和氨基酸。有研究表明，鮮雜魚[7]、水解蛋白[8]能有效地促進水產動物的生長。如果以冰凍鳀魚為原料，經過打漿后酶解而得到魚漿直接用于水產飼料中，避免魚粉生產的高溫對油脂、蛋白質的不利影響，可以很好地保持魚漿新鮮度和魚體特殊營養物質，同時具有強烈的誘食性。這在部分海水魚類飼料、尤其是肉食性魚類飼料中得到初步的應用，取得很好的養殖效果。但是，對酶解過程中生化成分變化的研究還不多。

本試驗在55℃條件下，通過外源木瓜蛋白酶促進酶解反應、抗生素抑制微生物繁殖對鳀魚進行酶解。將魚漿冷凍干燥，測定游離氨基酸、揮發性鹽基氮、生物胺、脂肪酸、丙二醛、過氧化值和酸價，對酶解過程中的生化變化規律進行研究，為鳀魚內源蛋白酶類的利用提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗設計

本試驗分為4個處理，分別用C、E、A、E+A表示。C：對照組。E：添加外源木瓜蛋白酶5 500 U/g。A：添加抗生素抑制微生物的生長，抗生素的用量為青霉素150 IU/g、鏈霉素150 μg/g，0、5 h各添加1次[9]。E+A：E、A處理中所用的抗生素及木瓜蛋白酶。然后對4個處理鳀魚在酶解過程中的營養成分變化進行分析，與商業魚粉比較。

1.2 試驗鳀魚

鳀魚由山東海圣飼料有限公司提供，為冰凍保存的鳀魚；商業魚粉由山東海圣飼料有限公司提供；木瓜蛋白酶為廣州鴻易食品添加劑有限公司產品。

選取完整的冰凍鳀魚，用絞肉機在鳀魚為冰凍狀態下絞碎，取一定量的魚漿于2 000 ml燒杯中，在55℃水浴鍋恒溫酶解。于0、3、5、7、9、12、24 h分別取樣，迅速于-20℃冷凍保存。真空冷凍干燥后備用。

1.3 主要成分的測定

水分測定采用真空冷凍干燥方法；粗蛋白測定采用凱氏定氮方法（GB/T 5009.5—2010）；粗脂肪測定采用索氏抽提方法（GB/T14772—2008）；灰分測定按照（GB/T 5009.4—2010）標準測定。

1.4 營養指標的測定

游離氨基氮測定采用茚三酮比色法；菌落總數測定采用GB/T 4789.2—2010方法；游離氨基酸測定采用SYKAM S—433D氨基酸分析儀；揮發性鹽基氮測定采用SC/T 3032—2007方法；生物胺測定采用液相色譜-串聯質譜法；丙二醛測定采用TBA比色法；過氧化值測定采用比色法（GB/T 5009.37—2003）；酸價測定采用GB/T 5009.37—2003方法；脂肪酸測定采用GB/T 17277—2008方法。

2 結果

2.1 鳀魚主要成分

鳀魚主要營養成分見表1。由表1可知，鳀魚的水分含量為76.08%，干物質為23.92%，含有豐富的蛋白質，具有較高的開發價值。將其水解成多肽、游離氨基酸，將更有利于魚類的吸收，提高鳀魚的利用率。

表1 鳀魚主要成分（%）

2.2 鳀魚酶解效果的分析

2.2.1 鳀魚酶解過程中游離氨基氮含量的變化

以自溶組（C組）魚漿為樣本，測定酶解樣品中游離氨基氮含量，結果見圖1。從圖1可知，在55℃條件下，酶解液中氨基氮的含量隨時間不斷增加，酶解前9 h氨基氮增加較快，9 h后增加緩慢，確定酶解時間為9 h。

圖1 鳀魚酶解過程中游離氨基氮含量的變化（濕重）

2.2.2 鳀魚酶解過程中細菌總數的變化

為探討酶解過程中細菌的生長、防止細菌對蛋白質類物質的腐敗作用和油脂的氧化作用，試驗A、E+A組添加抗生素，抗生素對鳀魚魚漿的抑菌效果見圖2。從圖2可知，C組、E組（無抗生素）魚漿中細菌總數隨時間的變化為∶7 h以前魚漿中細菌總數小于4×104CFU/g，而9 h細菌總數就超過了1×105CFU/g。添加了抗生素的A組、E+A組添加抗生素有效地抑制了微生物的繁殖，9 h細菌總數也沒有超過4×104CFU/g。因此，如果在實際生產中，為了避免魚漿中加入抗生素，在55℃自溶條件下，可以將酶解時間控制在7 h左右。

圖2 鳀魚酶解過程中細菌總數的變化

2.2.3 鳀魚酶解過程中蛋白質水解、腐敗產物的變化

2.2.3.1 氨基酸的變化（見表2）

表2中顯示了鳀魚酶解過程中游離氨基酸含量（FAA）的變化。從表2中可以看出，酶解9 h，FAA含量顯著升高，C組達到了14.97 g/100 g，C、A、E和E+A四個處理分別增加158.9%、168.1%、139.3%、145.8%。E組FAA含量比C組高532.20 mg/g，但與氨基酸含量相比，這一差異非常微小。C組FAA含量與A、E+A組差異同樣較小，僅為A、E+A組的1.08～1.09倍，而微生物約為600倍，表明FAA的生成主要受鳀魚蛋白酶作用，微生物的作用較弱。

2.2.3.2 揮發性鹽基氮的變化

魚漿酶解過程中揮發性鹽基氮（VBN）含量的變化見表3。從表3可知，VBN在酶解前3 h升高最快，5 h后A組VBN生成量顯著高于C組(P＜0.05)，微生物對VBN生成影響顯著(P＜0.05)。酶解9 h后，C組鹽基氮水平與加抗生素組(A組)揮發性鹽基氮差異顯著(P＜0.05)。酶解完成后，VBN分別升高了127.38%～135.96%。

2.2.3.3 生物胺的變化

鳀魚酶解過程中生物胺含量的變化見表4。由表4可知，酶解完成后，對照組組胺含量與原料魚差異不大，4個試驗組腐胺、精胺、亞精胺含量降低；試驗組尸胺含量升高86.9、98.5、190.2、104.7 mg/kg，A組比其它組高出34.47%～44.85%。

表2 鳀魚魚漿游離氨基酸含量的變化（干重）（mg/100 g）

表3 鳀魚酶解過程中揮發性鹽基氮的變化(干重)(mg/100 g)

表4 鳀魚魚漿生物胺含量的變化(干重)(mg/kg)

2.2.4 鳀魚酶解過程中油脂氧化的變化

2.2.4.1 脂肪酸組成的變化

鳀魚極易腐爛，不飽和脂肪酸含量較高，因此在酶解期間常出現脂肪氧化現象。鳀魚酶解后脂肪酸含量的變化見表5。從表5中可知，鳀魚不飽和脂肪酸（UFA）占脂肪總量的42.29%，酶解后UFA含量降低8.1%～10.4%，飽和脂肪酸（SFA）含量升高4.4%～6.4%，UFA酶解過程中部分轉化為SFA。A、E+A組UFA含量高于C、E組，微生物對UFA的轉化有一定影響。

表5 鳀魚酶解過程中脂肪酸的變化（干重）（mg/100 g）

2.2.4.2 脂肪酸氧化指標的變化

鳀魚酶解過程中丙二醛（MDA）、過氧化值（POV）、酸價（AV）的變化見表6。由表6可知，酶解過程中C組POV最高，A組最低，結束后A組比C組低41.71%、E組比C組低31.71%，差異顯著（P＜0.05），木瓜蛋白酶和抗生素都可降低POV，但抗生素效果更好。

表6 鳀魚酶解過程中MDA、POV、AV的變化（干重）

酶解過程中MDA含量也呈現先升高后降低的趨勢，各試驗組MDA峰值均在300 mg/kg左右（A組除外），C組峰值在5 h，E、E+A組在3 h，E+A組3 h后MDA含量迅速降低，而A組波動較小，酶解結束后MDA含量均低于初始階段。

各處理組的AV在前3 h迅速升高，3 h后升高速率降低，7 h后基本穩定，酶解完成后AV在3.30～3.46 mg/g之間。酶解過程中A組AV低于其它試驗組，與C組差異顯著，但A組酸價只比C組低0.16。E+A組AV高于A組，但E組與C組無顯著性差異，說明木瓜蛋白酶的作用被微生物抑制。

2.3 魚漿與商業魚粉的比較

以對照組魚漿與商業魚粉理化指標進行比較，結果見表7。由表7可知，試驗魚漿與魚粉理化指標差異較大，粗蛋白、粗脂肪、FAA、VBN含量分別比魚粉高出5.85%、84.29%、750.57%、1 154.20%，粗灰分、組胺、AV比魚粉低35.73%、19.35%、60%。

表7 魚漿與商業魚粉部分理化指標實測值（干重）

3 討論

3.1 酶解魚漿的營養指標

鳀魚蛋白質在內源蛋白酶作用下水解成多肽、游離氨基酸，均屬于氨基氮。55℃下酶解24 h游離氨基氮含量顯著升高，表明鳀魚魚漿酶解程度較高，后期游離氨基氮升高緩慢，水解反應降低?？赡苁敲附獬跗邝桇~內源蛋白酶活力較強，催化速率較快，隨著反應進行，蛋白酶活性降低，催化速率減慢；隨著酶解進行，反應底物減少，產物增加，抑制酶解反應進行。崔春在研究藍園鯵的自溶機制時提到，魚體自溶主要是鈣激活蛋白酶和胰蛋白酶發揮作用，高溫使蛋白酶迅速失活[10]。

外源木瓜蛋白酶、微生物對游離氨基酸含量影響較小，內源蛋白酶是主要作用，這與李平蘭等[11]在發酵香腸的研究結果相似。VBN含量的變化與水產品的腐敗程度存在明顯的對應關系，有研究表明，低溫貯存下細菌總數升高與VBN變化一致[12]。本研究中，VBN在酶解前3 h升高最快，此時微生物未進入繁殖期，表明在55℃下酶解9 h，微生物不是VBN變化的主要原因。生物胺由脫羧酶生成、胺氧化酶降解[13]，保存期內微生物種類變化大[14]，不同的微生物生成[15]、降解[16]生物胺能力不同。本試驗表明，在55℃酶解過程中微生物對組胺、腐胺、精胺、亞精胺主要表現為降解作用，對尸胺表現為生成作用。

鳀魚不飽和脂肪酸含量較高，這與蔣定文的研究結果相似[17]，但部分脂肪酸組成與之差異較大，可能與我們采用真空冷凍干燥而文獻報道的是60℃干燥樣品有關。MDA、AV、POV是評價油脂氧化的重要指標，抗生素能有效降低MDA、POV、AV，可能是降低了微生物的代謝活動產生的酸性物質，酶解完成后MDA低于原料魚，POV、AV水平低，表明魚漿油脂氧化程度不高。

魚漿酶解不經過脫脂處理，粗脂肪含量比商業魚粉高出84.29%，高于魚粉標準規定的11%（特級品）[18]。魚漿FAA含量比魚粉高1 154.2%，而FAA含量對魚類生長可能有重要作用。魚漿VBN含量為656.45 mg/kg，原因可能是酶解過程不經高溫，VBN揮發量減少。魚漿與商業魚粉理化指標差異較大，其對魚類生長的作用還有待進一步研究。

3.2 酶解條件的分析

周明明[1]在對鳀魚酶解的研究中發現催化水解反應的最適溫度為55℃左右，溫度較低時腐敗菌繁殖加快，會增加魚漿發生腐敗的危險。本試驗以抗生素防止細菌對蛋白質的腐敗作用和油脂的氧化作用。結果發現，在實際生產中，在55℃自溶條件下，不必添加抗菌劑，微生物對鳀魚魚漿營養成分變化影響較小，如需控制微生物數量可以將酶解時間控制在7～9 h。在對外源蛋白酶的研究中發現，外源木瓜蛋白酶對鳀魚魚漿影響較小，可能是所添加外源酶活力遠小于組織酶或木瓜蛋白酶在本試驗條件下活性，因此在實際生產中不需要添加外源酶。

4 結論

鳀魚的蛋白質含量為（17.71±0.36）%，在55℃條件下，鳀魚的最適酶解時間為7～9 h，酶解完成后游離氨基酸含量為14.97 g/100 g左右（干物質）。揮發性鹽基氮和尸胺含量升高顯著；組胺、腐胺、精胺、亞精胺含量降低，酶解過程對其表現為降解作用。酶解鳀魚不飽和脂肪酸部分轉化為飽和脂肪酸，酸價、丙二醛、過氧化值與原料魚差別不大，油脂氧化程度較低。在55℃條件下鳀魚蛋白質酶解迅速，蛋白質腐敗和油脂氧化主要受組織酶作用，外源木瓜蛋白酶、微生物對其影響較小。