聯合檢測蛋白ERCC1、Rad51和P53的表達與預測晚期非小細胞肺癌鉑類藥物化療療效的相關性研究

許柏松+馮耘

[摘要] 目的 檢測ERCC1、Rad5 1和P53在晚期非小細胞肺癌中的表達，探討其臨床意義和與鉑類藥物化療療效的相關性。 方法 選取我院2012年6月～2013年6月診斷為晚期非小細胞肺癌的68例患者病理學標本，采用免疫熒光組織化學染色法檢測晚期非小細胞肺癌患者標本和外周淋巴血細胞中ERCC1、Rad51和P53的表達，觀察ERCC1、Rad51和P53在晚期非小細胞肺癌患者標本和外周淋巴血細胞中表達的相關性；給予患者2～4個療程鉑類為基礎的標準化療方案，評價ERCC1、Rad51和P53蛋白的表達與化療療效相關性。 結果 晚期非小細胞肺癌患者標本和外周淋巴血細胞中ERCC1、Rad51和P53陽性率（分別為42.6%、35.3%和45.6%）和陰性表達率（分別為33.8%、27.9%和38.2%）相同，呈顯著正相關（均P<0.05）；ERCC1、Rad51和P53蛋白表達在患者年齡、性別、TNM分期、病理類型間無統計學意義（P<0.05）；ERCC1陽性表達患者鉑類藥物化療后總有效率為41.2%，顯著低于陰性患者化療后總有效率73.9%（P<0.05）；Rad51陽性表達患者化療后總有效率33.3%顯著低于陰性表達患者化療后總有效率63.2%（P<0.05）；P53陽性表達患者鉑類藥物化療后總有效率為29.0%，顯著低于陰性患者化療后總有效率53.8%（P<0.05）。 結論 檢測晚期非小細胞肺癌患者外周淋巴血細胞中ERCC1、Rad51和P53表達可很好反映其在癌組織中的表達情況；ERCC1、Rad51和P53表達較低的患者鉑類藥物治療有效率更好，ERCC1、Rad51和P53對化療療效的預測為負相關。

[關鍵詞] 晚期非小細胞肺癌；ERCC1；Rad51；P53；鉑類藥物；有效率；相關性

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）23-30-05

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌的80%以上，NSCLC大約占了所有肺癌病例的85%，每年大約有超過180萬例新增肺癌病例（所有腫瘤中占13%）和160萬例肺癌相關死亡病例（所有腫瘤中占19.4%）[1]。僅有三分之一的NSCLC患者存在手術治療的機會，約70%的患者在就診時已屬局部晚期（Ⅲ期、Ⅳ期）或是出現遠處轉移，5年生存率僅為15%[2]。幾十年來大量臨床研究證實以鉑為基礎的化療是NSCLC唯一的全身治療方案，以鉑類為基礎的化療方案已成為NSCLC的標準化化療方案[3]，臨床上患者對這類藥物存在較大個體差異，化療結果存在較大差異，通過損傷DNA殺死癌細胞的化療過程同樣會削弱療效，而DNA修復能力在腫瘤的發生、發展及治療耐受中其重要作用，因此化療前檢測相關耐藥基因或基因表達產物可使化療藥物應用更加個體化[4]。ERCC1（核苷酸切除修復交叉互補組1）是順鉑誘導DNA損傷修復中的關鍵酶，其高表達與鉑類制劑的耐藥性有關[5]。Rad51表達水平升高可使腫瘤細胞對放療和化療藥物產生耐受作用[6]。P53基因是人類腫瘤中突變頻率最高的抑癌基因，在DNA致損傷物誘發的凋亡過程中起重要作用[7]。本研究通過免疫熒光組織化學染色檢測ERCC1、Rad51和P53在晚期非小細胞肺癌中和外周淋巴血細胞的表達，觀察觀察ERCC1、Rad51和P53在晚期非小細胞肺癌患者標本和外周淋巴血細胞中表達的相關性，和其與鉑類藥物化療療效的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2012年～2013年診斷為晚期非小細胞肺癌的68例患者病理學標本，所有患者均經過病理學檢查后確診為晚期NSCLC患者，未經過化療治療。TNM分期采用國際抗癌聯盟（UICC）2009年修訂的分期標準[8]。68例患者中男41例，女27例，年齡32～78歲，平均（57.0±9.3歲），晚期NSCLC患者為Ⅲ期、Ⅳ期患者，Ⅲ期50例，Ⅳ期18例。病理類型分別為23例鱗癌，20例腺癌，15例肺泡細胞癌和10例腺鱗癌。排除肝、腎功能不全患者，化療前功能狀態KPS60分以上。

1.2 標本處理

晚期NSCLC標本：采用免疫熒光組織化學染色方法，取患者新鮮癌組織以石蠟包埋，脫蠟水化后加H2O2（濃度3%）除去內源性過氧化物，微波抗原修復10min，滴加正常血清封閉液，室溫溫育30min，滴加一抗（1∶100倍稀釋），37度1h，滴加生物素化二抗，37度10min，滴加試劑SABC，37度10min，DAB顯色10min，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

外周淋巴血細胞（PBS）處理：化療前1日抽取患者空腹靜脈血4mL置于10mL離心管中，加入4mL淋巴細胞分離液，小心加入抗凝血（肝素），放入離心機中以2000r/min進行3min離心作用，吸取乳白色淋巴細胞層，放入PBS 4mL洗滌，1000r/min離心10min，將細胞濃度調至1×106/L，取5μL細胞懸液在預先多聚賴氨酸包被的載玻片上，風干后待測，鏈菌素抗生物素-生物素（1abeled streptavidin—biotn，LSAB）免疫組化法對標本中的ERCC1、Rad51和P53進行染色。試劑購自深圳達科為生物技術有限公司的鼠抗人單克隆ERCC1抗體、Rad51抗體、P53抗體和過氧化物酶標記的鏈酶卵白（SP）試劑盒。

1.3 化療治療

所有患者均簽定化療知情同意書，至少完成2個療程鉑類藥物化療方案。68例患者均為靜脈注射，化療方案以卡鉑和順鉑為主，分別為：順鉑/吉西他濱（DDP+GEM），DDP劑量30mg/m2，d2-4，GEM劑量 1000mg/m2，d1，8；順鉑/多系紫杉醇（DDP+TXT），DDP劑量45mg/m2，d2，TXT劑量60mg/m2，d1；紫杉醇/卡鉑（PTX+CBP），PTX劑量135mg/m2，d1，卡鉑AUC（曲線下面積）5，d1。給予患者2～4個療程，每3～4周為1個療程。2個療程后可進行療效評價。endprint

1.4 化療療效評價標準

肺癌放射及化學治療療效判定標準化療參照WHO實體瘤療效評價標準（1981）[9]：完全緩解（CR），腫瘤完全消失超過1個月。部分緩解（PR），腫瘤最大直徑及最大垂直直徑的乘積縮小達50%，其他病變無增大，持續超過1個月。病變穩定（SD），病變兩徑乘積縮小不超過50%，增大不超過25%，持續超過1個月。病變進展（PD），病變兩徑乘積增大超過25%。

1.5 標本結果判斷標準

在400-k顯微鏡下觀察ERCC1、Rad51和P53蛋白陽性表達主要位于細胞核，呈棕黃色。根據Wachters等[10]方法分析ERCC1、Rad51和P53水平，陽性表達（+）：視野中陽性細胞>10%；陰性表達（-）：視野中無表達或陽性細胞<10%。

1.6 統計學分析

所有數據采用SPSS15.0統計學軟件進行分析，計數資料用x2檢驗，以P<0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ERCC1、Rad51和P53在晚期NSCLC標本和PBS中表達的相關性

ERCC1、Rad51和P53蛋白表達在晚期NSCLC標本中陽性患者分別為42.6%（29/68）、35.3%（24/68）和45.6%（31/68），陰性表達患者為33.8%（23/68）、27.9%（19/68）和38.2%（26/68）；ERCC1、Rad51和P53蛋白表達在PBS中陽性表達和陰性表達患者數一致，ERCC1、Rad51和P53在晚期NSCLC標本和PBS中表達呈顯著正相關（r值分別為19.43、22.56和21.78，均P<0.05）。

2.2 ERCC1、Rad51和P53在晚期NSCLC標本陽性和陰性表達情況

根據標本結果判斷標準，晚期期NSCLC患者癌標本組織中ERCC1、Rad51和P53蛋白陽性表達主要位于細胞核中，呈黃棕色，其中ERCC1、Rad51和P53蛋白表達在患者年齡、性別、TNM分期、病理類型間差異無統計學意義（P>0.05）。詳見表1。

2.3 ERCC1、Rad51和P53的表達與鉑類藥物化療療效分析

ERCC1陽性表達患者鉑類藥物化療后總有效率為41.2%，顯著低于陰性患者化療后總有效率73.9%（P<0.05）；Rad51陽性表達患者化療后總有效率33.3%顯著低于陰性表達患者化療后總有效率63.2%（P<0.05）；P53陽性表達患者鉑類藥物化療后總有效率為29.0%，顯著低于陰性患者化療后總有效率53.8%（P<0.05）。詳見表2。

3 討論

肺癌根據生物學特性分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌兩大類，非小細胞肺癌又包括鱗癌、腺癌、大細胞癌和鱗腺癌（腺鱗癌），近年來國內學者發現腺癌所占的比例在近30年有增高的趨勢[11]。非小細胞肺癌占所有病例的80%～85%，80%的肺癌在診斷后的1年內死亡[9]。多年來鉑類藥物已成為治療晚期NSCLC的標準化方案，鉑類藥物進入癌細胞后，與DNA結合成Pt-DNA加合物，形成DNA鏈內交聯或鏈間交聯及DNA蛋白質交聯，引起DNA分子結構斷裂，破壞DNA螺旋體結構，致使腫瘤細胞凋亡[4]。癌細胞DNA損傷主要通過核苷酸切除修復系統（NER）進行修復，是鉑類藥物間接耐藥或敏感的主要途經[12]。

近年來有研究表明，體外培養的卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌及NSCLC等細胞加入鉑類藥物后，鉑類藥物低抗與ERCC1蛋白mRNA表達有關，ERCC1蛋白含量不足時，不能修復損傷的DNA，細胞死亡，因此ERCC1蛋白對NER途經有著關鍵作用，NER進程完成后，DNA即被修復正常[13]。ERCC1與DNA修復酶通過互補基因形成一個特異性的而連接5端核苷酸內切酶，具有識別和切除5端的關鍵作用，ERCC1基因缺陷個體在DNA修復上有致命缺陷[5]。一些研究表明ERCC1表達與肺癌的發生及化療抵抗有密切相關性，晚期NSCLC患者ERCC1高表達使鉑類藥物所致DNA損傷的修復增加，降低化療療效[14]。Olaussen等[15]對761例肺癌患患者標本ERCC1表達情況分析發現，低水平ERCC1患者鉑類藥物治療后在生存獲益上有顯著統計學差異。

Rad51（DNA損傷修復蛋白）是NSCLC中重要分子事件，有文獻報道稱高Rad51（DNA損傷修復蛋白）水平導致非小細胞肺癌細胞對鉑類藥物產生耐藥性[6]，有研究表明近30%的NSCLC為Rad51高表達。Rad51表達升高導致NSCLC細胞A549對鉑類藥物產生耐藥性，導致這種作用可能與Rad51升高可提高癌細胞DNA修復能力[6]。Rad51對正常細胞生命和生理功能的維持有重要作用，Rad51還有希望成為未來臨床治療靶點。

研究發現P53蛋白過度表達與腫瘤發生、發展和耐藥性產生有密切關聯，P53通過轉錄激活依賴途徑和重組激活非依賴途徑調節DNA修復[16]，腫瘤細胞暴露于抗癌藥物時，文獻表明P53高表達促使腫瘤細胞發生耐藥性，其中與NSCLC耐藥性相關，晚期（Ⅲ期、Ⅳ期）患者紫杉醇耐藥性產生與P53過表達相關[7]，目前國內外關于P53表達與肺癌腫瘤細胞對化療藥物敏感性關系的體內研究還較少。我國沈宗麗等[17]研究顯示70.6%的惡性腫瘤患者P53在 PBS中過表達顯著高于正常人，且外周血P53取樣容易，檢測操作簡便，可作為腫瘤易感人群篩查的一項指標。

本研究在以上文獻報道的基礎上，通過免疫熒光組織化學染色檢測ERCC1、Rad51和P53在晚期非小細胞肺癌中和外周淋巴血細胞的表達，觀察其在晚期非小細胞肺癌患者標本和外周淋巴血細胞中表達的相關性和與鉑類藥物化療療效的相關性。結果顯示晚期NSCLC標本和外周淋巴血細胞中ERCC1、Rad51和P53陽性率和陰性表達率相同，呈顯著正相關（均P<0.05），本名研究認為檢測晚期非小細胞肺癌患者外周淋巴血細胞中ERCC1、Rad51和P53表達可很好反映其在癌組織中的表達情況；ERCC1、Rad51和P53蛋白表達在患者年齡、性別、TNM分期、病理類型間無統計學意義（P<0.05）；ERCC1陽性表達患者鉑類藥物化療后總有效率為41.2%，顯著低于陰性患者化療后總有效率73.9%（P<0.05）；Rad51陽性表達患者化療后總有效率33.3%顯著低于陰性表達患者化療后總有效率63.2%（P<0.05）；P53陽性表達患者鉑類藥物化療后總有效率為29.0%，顯著低于陰性患者化療后總有效率53.8%（P<0.05），我們認為ERCC1、Rad51和P53表達較低的患者鉑類藥物治療有效率更好，ERCC1、Rad51和P53對化療療效的預測為負相關。本研究由于樣本量較少，免疫組化法檢測ERCC1、Rad51和P53蛋白表達結果存在一定局限性，還需有大量樣本研究進行深入探討。endprint

[參考文獻]

[1] 徐志巧，張燕.聯合檢測蛋白ERCC1、Rad51和P53的表達與預測晚期非小細胞肺癌鉑類藥物化療療效的比較[J].醫藥論壇雜志，2011，32（1）：122-124.

[2] Froesch P，Martucci F.Management of non-small cell lung cancer in the elderly[J].Eur J Intern Med，2014，31.

[3] Jett JR，Carr LL.Targeted therapy for non-small cell lung cancer[J].Am J Respir Crit Care Med，2013，188（8）：907-912.

[4] Rose MC，Kostyanovskaya E，Huang RS2.Pharmacogenomics of Cisplatin Sensitivityin Non-small Cell Lung Cancer[J].Genomics Proteomics Bioinformatics，2014，12（5）：198-209.

[5] Cubukcu E，Fatih Olmez O.et al.Immunohistochemical expression of excision repair cross-complementing 1 （ERCC1） in non-small-cell lung cancer：implications for patient outcome[J].Clin Transl Oncol，2011，13（11）：826-830.

[6] Ko JC，Chen HJ，et al.HSP90 inhibition induces cytotoxicity via down-regulation of Rad51 expression and DNA repair capacity in non-small cell lung cancer cells[J].Regul Toxicol Pharmacol，2012，64（3）：415-424.

[7] Kasinski AL，Kelnar K，et al.A combinatorial microRNA therapeutics approach to suppressing non-small cell lung cancer[J].Oncogene，2014，1.

[8] 第7版肺癌TNM分期及影像學在其評估中的價值[J].放射學實踐，2012，27（7）：83.

[9] 非小細胞肺癌臨床實踐指南（中國版）[M].2010年，（第一版）

[10] Wachters FM，Wong LS，Timens W，et a1.ERCC1，hRad5 1，and BRCA1 protein expression in relation ttumor response and survial of stage Ill/IV NSCLC pa—tients treated with chemotherapy[J].Lung Cancer，2005，50（2）：211-219.

[11] Patrick M Forde，David S Ettinger.Targeted therapy for non-small-cell lung cancer：past，present[J]. Expert Rev Anticancer Ther，2013，13（6）：745–758.

[12] Parikh PM，Vaid A et al.Randomized，double-blind，placebo-controlled phase II study of single-agent oral talactoferrin in patients with locally advanced or metastatic non-small-cell lung cancer that progressed after chemotherapy[J].J Clin Oncol，2011，29（31）：4129-4136.

[13] Gao Z，Han B，Shen J，et al.ERCC1 protein as a guide for individualized therapy of late-stage advanced non-small cell lung cancer[J].Exp Ther Med，2011，2（5）：811-815.

[14] Ryu JS，Memon A，Lee SK.ERCC1 and personalized medicine in lung cancer[J].Ann Transl Med，2014 ，2（4）：32.

[15] Bepler G，Olaussen KA，et al.ERCC1 and RRM1 in the international adjuvant lung trial by automated quantitative in situ analysis[J].Am J Pathol，2011，178（1）：69-78.

[16] Huang S，Benavente S，et al.p53 modulates acquired resistance to EGFR inhibitors and radiation[J]. Cancer Res，2011，71（22）：7071-7079.

[17] Park KS，Martelotto LG，et al.A crucial requirement for Hedgehog signaling in small cell lung cancer [J].2011，17（11）：1504-1508.

（收稿日期：2014-12-15）endprint

[參考文獻]

[1] 徐志巧，張燕.聯合檢測蛋白ERCC1、Rad51和P53的表達與預測晚期非小細胞肺癌鉑類藥物化療療效的比較[J].醫藥論壇雜志，2011，32（1）：122-124.

[2] Froesch P，Martucci F.Management of non-small cell lung cancer in the elderly[J].Eur J Intern Med，2014，31.

[3] Jett JR，Carr LL.Targeted therapy for non-small cell lung cancer[J].Am J Respir Crit Care Med，2013，188（8）：907-912.

[4] Rose MC，Kostyanovskaya E，Huang RS2.Pharmacogenomics of Cisplatin Sensitivityin Non-small Cell Lung Cancer[J].Genomics Proteomics Bioinformatics，2014，12（5）：198-209.

[5] Cubukcu E，Fatih Olmez O.et al.Immunohistochemical expression of excision repair cross-complementing 1 （ERCC1） in non-small-cell lung cancer：implications for patient outcome[J].Clin Transl Oncol，2011，13（11）：826-830.

[6] Ko JC，Chen HJ，et al.HSP90 inhibition induces cytotoxicity via down-regulation of Rad51 expression and DNA repair capacity in non-small cell lung cancer cells[J].Regul Toxicol Pharmacol，2012，64（3）：415-424.

[7] Kasinski AL，Kelnar K，et al.A combinatorial microRNA therapeutics approach to suppressing non-small cell lung cancer[J].Oncogene，2014，1.

[8] 第7版肺癌TNM分期及影像學在其評估中的價值[J].放射學實踐，2012，27（7）：83.

[9] 非小細胞肺癌臨床實踐指南（中國版）[M].2010年，（第一版）

[10] Wachters FM，Wong LS，Timens W，et a1.ERCC1，hRad5 1，and BRCA1 protein expression in relation ttumor response and survial of stage Ill/IV NSCLC pa—tients treated with chemotherapy[J].Lung Cancer，2005，50（2）：211-219.

[11] Patrick M Forde，David S Ettinger.Targeted therapy for non-small-cell lung cancer：past，present[J]. Expert Rev Anticancer Ther，2013，13（6）：745–758.

[12] Parikh PM，Vaid A et al.Randomized，double-blind，placebo-controlled phase II study of single-agent oral talactoferrin in patients with locally advanced or metastatic non-small-cell lung cancer that progressed after chemotherapy[J].J Clin Oncol，2011，29（31）：4129-4136.

[13] Gao Z，Han B，Shen J，et al.ERCC1 protein as a guide for individualized therapy of late-stage advanced non-small cell lung cancer[J].Exp Ther Med，2011，2（5）：811-815.

[14] Ryu JS，Memon A，Lee SK.ERCC1 and personalized medicine in lung cancer[J].Ann Transl Med，2014 ，2（4）：32.

[15] Bepler G，Olaussen KA，et al.ERCC1 and RRM1 in the international adjuvant lung trial by automated quantitative in situ analysis[J].Am J Pathol，2011，178（1）：69-78.

[16] Huang S，Benavente S，et al.p53 modulates acquired resistance to EGFR inhibitors and radiation[J]. Cancer Res，2011，71（22）：7071-7079.

[17] Park KS，Martelotto LG，et al.A crucial requirement for Hedgehog signaling in small cell lung cancer [J].2011，17（11）：1504-1508.

（收稿日期：2014-12-15）endprint

[參考文獻]

[1] 徐志巧，張燕.聯合檢測蛋白ERCC1、Rad51和P53的表達與預測晚期非小細胞肺癌鉑類藥物化療療效的比較[J].醫藥論壇雜志，2011，32（1）：122-124.

[2] Froesch P，Martucci F.Management of non-small cell lung cancer in the elderly[J].Eur J Intern Med，2014，31.

[3] Jett JR，Carr LL.Targeted therapy for non-small cell lung cancer[J].Am J Respir Crit Care Med，2013，188（8）：907-912.

[4] Rose MC，Kostyanovskaya E，Huang RS2.Pharmacogenomics of Cisplatin Sensitivityin Non-small Cell Lung Cancer[J].Genomics Proteomics Bioinformatics，2014，12（5）：198-209.

[5] Cubukcu E，Fatih Olmez O.et al.Immunohistochemical expression of excision repair cross-complementing 1 （ERCC1） in non-small-cell lung cancer：implications for patient outcome[J].Clin Transl Oncol，2011，13（11）：826-830.

[6] Ko JC，Chen HJ，et al.HSP90 inhibition induces cytotoxicity via down-regulation of Rad51 expression and DNA repair capacity in non-small cell lung cancer cells[J].Regul Toxicol Pharmacol，2012，64（3）：415-424.

[7] Kasinski AL，Kelnar K，et al.A combinatorial microRNA therapeutics approach to suppressing non-small cell lung cancer[J].Oncogene，2014，1.

[8] 第7版肺癌TNM分期及影像學在其評估中的價值[J].放射學實踐，2012，27（7）：83.

[9] 非小細胞肺癌臨床實踐指南（中國版）[M].2010年，（第一版）

[10] Wachters FM，Wong LS，Timens W，et a1.ERCC1，hRad5 1，and BRCA1 protein expression in relation ttumor response and survial of stage Ill/IV NSCLC pa—tients treated with chemotherapy[J].Lung Cancer，2005，50（2）：211-219.

[11] Patrick M Forde，David S Ettinger.Targeted therapy for non-small-cell lung cancer：past，present[J]. Expert Rev Anticancer Ther，2013，13（6）：745–758.

[12] Parikh PM，Vaid A et al.Randomized，double-blind，placebo-controlled phase II study of single-agent oral talactoferrin in patients with locally advanced or metastatic non-small-cell lung cancer that progressed after chemotherapy[J].J Clin Oncol，2011，29（31）：4129-4136.

[13] Gao Z，Han B，Shen J，et al.ERCC1 protein as a guide for individualized therapy of late-stage advanced non-small cell lung cancer[J].Exp Ther Med，2011，2（5）：811-815.

[14] Ryu JS，Memon A，Lee SK.ERCC1 and personalized medicine in lung cancer[J].Ann Transl Med，2014 ，2（4）：32.

[15] Bepler G，Olaussen KA，et al.ERCC1 and RRM1 in the international adjuvant lung trial by automated quantitative in situ analysis[J].Am J Pathol，2011，178（1）：69-78.

[16] Huang S，Benavente S，et al.p53 modulates acquired resistance to EGFR inhibitors and radiation[J]. Cancer Res，2011，71（22）：7071-7079.

[17] Park KS，Martelotto LG，et al.A crucial requirement for Hedgehog signaling in small cell lung cancer [J].2011，17（11）：1504-1508.

（收稿日期：2014-12-15）endprint