葡萄脫毒與病毒檢測技術研究進展

姚延興 金莉 宿福園 李長林 楊守坤 裴忺

（湖北省武漢市林業果樹科學研究所 武漢 430065）

葡萄脫毒與病毒檢測技術研究進展

姚延興 金莉 宿福園 李長林 楊守坤 裴忺

（湖北省武漢市林業果樹科學研究所 武漢 430065）

葡萄（Vitisspp.）是全世界主栽果樹之一，由于其主要通過扦插和嫁接等無性繁殖方法進行繁殖，導致葡萄易被病毒感染,病毒在植株內長期積累和重復感染。使得葡萄病毒病具有種類多、分布廣、危害大的特點[1]，已成為全世界關注的果樹問題之一[2]。

脫毒和病毒檢測是實現葡萄無毒化栽培的關鍵技術，目前常用脫毒方法有熱處理脫毒法、莖尖培養脫毒法和使用病毒抑制劑抗毒法，比較理想的脫毒方法是將這三種方法結合使用。

1 葡萄主要病毒病侵害的研究

1.1 葡萄扇葉病

葡萄扇葉?。℅rapevine fan leaf disease）起源于歐洲、北美的葡萄砧木，是目前研究最深入的一種葡萄病毒病，也是世界上分布最廣泛的葡萄病毒病之一。該病的病原為豇豆花葉病毒科線蟲傳多面體病毒屬病毒，主要是通過葡萄無性繁殖傳播，也可通過土壤線蟲進行傳播。病株癥狀可表現為葉片呈扇子狀、黃化，成熟葉片沿主脈產生黃斑，葉片畸形、不對稱，葉蔓從生、矮化，葉柄凹大開張。該病導致果實產量下降，并降低果實品質[3]。1990年代，人們對該病毒進行了全部核酸序列測定和外殼蛋白基因的序列分析[4][5]，有效解決了該病毒在不同株系、不同品種上的癥狀表現差異大，難以通過癥狀進行鑒定的難題。

1.2 葡萄卷葉病

葡萄卷葉?。℅rapevine leaf roll disease）分布廣泛，所有葡萄品種皆會發生此病。該病毒的病原葡萄卷葉病毒，是長線形病毒科長線形病毒屬病毒，主要通過葡萄無性繁殖進行傳播。卷葉病具有階段隱癥的特點，通常感病后不會立即表現出癥狀，生長后期才會表現出明顯癥狀，且癥狀因病株生長條件的不同也會表現出差異。主要表現為葉片向背面反卷，葉脈間出現壞死斑，病葉除葉脈外葉片變為紅色或紅褐色，病株果穗變小，品質下降，產量降低[6]，該病還可導致葡萄果實成熟推遲，扦插難成活，抗逆性差。該病癥狀在夏末秋初尤為明顯。

1.3 葡萄栓皮病

葡萄栓皮?。℅rapevine corky bark diaease）是由一種潛隱性病毒侵染而引起的病毒病，該病相關報道相對較少，病原目前尚不清楚。該病主要是通過嫁接傳播，Hewitt于1954年首次對葡萄栓皮病的癥狀進行了描述[7]，癥狀表現為病株萌芽遲緩，枝蔓和樹皮產生裂縫，葉片變小、下卷，果實延遲成熟，品質下降。

1.4 葡萄莖痘病

葡萄莖痘?。℅rapevine stem-pittingdisease）可以通過嫁接傳播，其病原尚不清楚。據報道，通過核苷酸序列比對發現，葡萄莖痘病毒（Grapevinestem-pitting disease）與蘋果莖痘病毒（Aapple stempitting virus）、馬鈴薯 M病毒（Potato stem-pittingvirus）和馬鈴薯X病毒（Potato X virus） 相似[8]。另有研究報道，該病可能與番茄環斑病毒（Tomato ringspot Nepovirus） 和葡萄扇葉病毒有關。植株感染此病后春天萌芽遲，樹體生長緩慢、矮小，長勢衰弱，樹皮粗糙、木栓化，嫁接口愈合能力下降。

1.5 葡萄斑點病

葡萄斑點?。℅rapevine fleck disease）是一類在大多數葡萄種上不表現出癥狀的病毒病，沙地葡萄是此病害較好的指示植物。該病的病原為直徑大約30nm的球狀葡萄斑點病毒。該病毒主要通過嫁接進行傳播，對葡萄植株進行潛伏侵染，大多數葡萄感染此病毒后，田間并不表現癥狀，但在沙地葡萄上癥狀表現明顯，感病植株的葉片會出現局部斑點，在三、四級小葉脈上出現脈明，同時出現葉片皺縮、扭曲并向上卷曲的癥狀，還可出現不同程度矮化現象。

2 葡萄主要脫毒技術的研究

2.1 熱處理脫毒

熱處理脫毒主要是指應用不影響寄主植物正常生長的高溫，利用病毒在高溫下不穩定的特點，將攜帶病毒的葡萄植株或組織器官在高溫下進行培養，使病毒在高溫下鈍化、失活，達到脫毒目的，熱處理包括恒溫處理和變溫處理兩種方式，由于受到植物對高溫忍耐度的限制，單獨使用該法脫毒率較低，且高溫僅對圓形和線性病毒有效，對桿狀病毒不起作用[9]。

2.2 莖尖培養脫毒

莖尖培養是目前應用最廣泛的脫毒方法之一，其脫毒原理是根據病毒粒子在植物體內的分布不均勻，植物莖尖和根尖內病毒含量很低或不含病毒的特點，利用莖尖為外植體進行組織培養獲得無毒苗木。早在1960年代，人們已開始利用莖尖培養進行葡萄脫毒研究[10]。莖尖大小與脫毒效果成反比，而莖尖離體培養再生率與莖尖大小成正比。因此，采用適當大小的莖尖進行離體培養，是脫毒成功與否的關鍵因素。據報道，莖尖大小在 0.2～ 0.5mm之間時葡萄脫毒效果較好[11]。

2.3 化學處理脫毒

化學抑制劑主要是通過延遲或抑制病毒的復制而發揮作用的[12]。目前主要的病毒抑制劑有病毒唑、板藍根、鳥嘌呤和尿嘧啶類等多種物質，在植物組織培養過程中，在培養基中加入適當的病毒抑制劑，可以達到脫除外植體病毒的效果。如在1980年，Cassells在馬鈴薯組織培養過程中，通過在培養基中加入病毒唑，獲得了馬鈴薯脫毒植株[13]。

目前，葡萄脫毒常用的方法就是以上 3種，但每種脫毒方法都有自身的不足。實際生產中，通常將幾種脫毒方法結合使用，其中應用最廣泛的是熱處理與莖尖培養結合脫毒，可獲得較好的脫毒效果。

3 葡萄病毒檢測技術的研究

3.1 指示植物檢測法

指示植物檢測病毒法的原理就是利用某些植物對某些病毒的感染非常敏感，能夠很快表現出病征的特性來檢測植株是否帶毒，常采用汁液摩擦和嫁接傳染的方法對指示植物進行病毒接種。該方法是常用的病毒檢測技術，具有成本低，操作簡便的優點。在葡萄栓皮病毒和葡萄扇葉病毒的檢測中取得了很好的效果[14]，但對復合侵染或具有階段性隱性癥狀特點的病毒無法通過該法檢測。

3.2 血清學檢測法

3.3 分子生物學檢測法

分子生物學檢測是從核酸水平來檢測病毒是否存在，主要包括聚合酶鏈式反應（PCR）、雙鏈RNA（dsRNA）法及分子雜交法。其中，聚合酶鏈式反應又包括反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）和免疫捕捉反轉錄聚合酶鏈式反應（IC-RT-PCR），因為比血清學方法靈敏度高，所以，分子生物學檢測法應用更廣。

3.3.1 聚合酶鏈式反應技術。PCR病毒檢

由于病毒可以刺激機體產生相應的抗體，而這種抗體與其相應的抗原可發生特異反應，因此可通過已知病毒的抗血清來鑒定病毒種類，血清學方法檢測植物病毒就是利用了血清反應的這一原理來實現的。酶聯免疫吸附測定（ELISA）是目前應用最多的血清學檢測法，此法主要包括雙抗體夾心法ELISA（DAS-ELISA）和 A蛋白雙抗夾心ELISA兩種，其中，DAS-ELISA在植物病毒檢測中應用的更為廣泛。ELISA在對葡萄扇葉病毒、葡萄卷葉病毒的檢測中均獲得了很好的效果[15-16]。但是，血清學檢測法在實際應用中存在易產生假陽性的缺陷，降低了其使用效率。測技術主要包括反轉錄RT-PCR和IC-RT-PCR兩種。PCR技術可以對任何植物病毒基因組的少量DNA進行擴增，再利用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測[17]。RT-PCR檢測法是利用大多數植物病毒為RNA病毒這一特點，進行病毒檢測前，將病毒RNA反轉錄合成cDNA，然后將cDNA進行連續擴增，用于病毒檢測分析。IC-RT-PCR法是將ELISA與RTPCR相結合進行病毒檢測的方法。前人的研究發現，對葡萄病毒的檢測中，IC-RT-PCR檢測效果優于DAS-ELISA和RT-PCR[18]。

3.3.2 雙鏈RNA法。由于絕大多數植物病毒基因組為單鏈RNA，病毒侵染植物組織后會復制、配對成具有特異性的雙鏈RNA，只要植物組織中存在病毒，就會存在與其對應的dsRNA，因而可以利用這些dsRNA對植物組織進行病毒檢測[19]。主要技術方法是提取感病組織中的dsRNA，然后進行凝膠電泳分析，根據dsRNA譜帶的遷移率確定感染病毒的種類[20]。1970年代末期，dsRNA法已經開始用于植物病毒的研究當中[21]，到1990年代，Habili等又從感染葡萄卷葉病毒的葡萄植株中提取到三種特異性的大分子dsRNA，大小分別為19.5kb，1.9kb，0.9kb[22]。

3.3.3 分子雜交法。分子雜交法又稱為核酸探針檢測法，起源于1980年代，是利用病毒核苷酸的互補序列作為探針，與病毒核苷酸單鏈通過堿基配對形成雜合雙鏈，對病毒整個基因組或部分基因組進行檢測與分析的方法。常見的雜交方法包括斑點雜交、印跡原位雜交和印跡法等。對于DNA、RNA及類病毒，均可用分子雜交法進行檢測，且特異性強、靈敏度高、操作簡便。目前，許多種類葡萄病毒如：葡萄卷葉病毒、葡萄扇葉病毒的核酸探針都已合成且已成功用于病毒檢測[23]，其中，對葡萄扇葉病毒分子雜交檢測靈敏度已達到pg級水平[24]。

4 現狀及展望

目前，葡萄產業發展迅猛，葡萄種植面積不斷擴大，但病毒病的危害也日益嚴重，對葡萄的品質與產量都造成了嚴重影響。為了克服或降低病毒病帶來的危害，科技工作者不斷努力，各種脫毒方法也應運而生，但葡萄脫毒效果與葡萄品種及所采用的脫毒方法都有關系。當前實際生產中，任意一種脫毒方法單獨作用，效果通常無法令人滿意，通常多種脫毒方法結合使用脫毒效果較好。在脫毒效果檢測方面，指示植物法與血清學檢測法操作繁瑣，檢測結果易受假陽性干擾，使用范圍有限。分子生物學檢測法，靈敏度高，操作簡便快速，在葡萄病毒檢測方面具有巨大潛力和發展前景。

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10.139906/j.cnki.zjjgjj.1009-0584.2015.03.221

2015- 5- 8