骨骼肌來源干細胞治療壓力性尿失禁的研究進展

王文莉 綜述 段 華 審校

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院婦科微創中心，北京 100006)

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·文獻綜述·

骨骼肌來源干細胞治療壓力性尿失禁的研究進展

王文莉 綜述 段 華*審校

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院婦科微創中心，北京 100006)

干細胞局部注射治療壓力性尿失禁(stress urinary incontinence, SUI)是一種新興的微創療法，干細胞不僅可以分裂融合為肌細胞并自我更新，還可以分泌各種生長因子，促進局部神經及肌肉組織再生，從解剖功能上修復括約肌功能障礙。本文就骨骼肌來源的干細胞治療SUI的療效及相關風險進行綜述。

壓力性尿失禁； 干細胞； 神經纖維

壓力性尿失禁(stress urinary incontinence，SUI)是經完整的尿道不隨意地遺尿，在大笑、咳嗽等增加腹內壓的活動時即可引起排尿。世界上約35%的成年女性患有不同程度的SUI[1]。研究表明SUI患者的盆底肌及尿道平滑肌存在萎縮、變形等退行性變，盆底及尿道周圍橫紋肌松弛，尿道平滑肌張力減退，膀胱頸及尿道位置降低使尿道傾斜角增大，膀胱尿道后角消失，當膀胱內壓增高時，尿道阻力不足以控制尿液而導致SUI的發生，嚴重影響患者的生活質量。隨著社會進步、老齡化程度增高及人們對生活質量要求的不斷提高，SUI的患病率、就診率逐年上升[2，3]。目前，SUI的治療方法多種多樣，保守治療風險較小，但遠期效果欠佳，復發率高；手術療效肯定但適應人群有限，且風險較大[4]。干細胞局部注射治療作為一種SUI新興的微創療法[5]，不僅對盆底起填充作用，還能作為肌源性纖維的來源分裂融合為肌纖維，分泌各種生長因子，促進局部神經及肌肉組織再生，持久性強，重建盆底組織功能，從解剖功能上修復括約肌功能障礙[6]。尿道括約肌骨骼肌干細胞移植與Burch陰道壁懸吊術(Burch colposuspension)、經陰道無張力尿道中段吊帶術(middle urethral tension-free vaginal tape, TVT)及經閉孔無張力尿道中段吊帶術(transobturator tension-free vaginal tape, TOT)療效的對比研究結果顯示，干細胞組明顯優于吊帶植入組[6，7]。同時，自體干細胞還可作為載體將外源基因導入體內行基因治療，為治愈SUI帶來希望。本文就骨骼肌來源的干細胞治療SUI的療效及相關風險進行綜述。

1 骨骼肌來源干細胞的基礎研究

在早期胚胎、骨髓、臍帶、胎盤和部分成年人細胞中均存在干細胞，具有無限自我復制、自我更新以及全能或多能分化能力，不同來源的干細胞分化潛能各異，在適當的條件下，可以分化成多種細胞系并形成各種具有明確功能的組織或器官，是形成器官和組織的基礎細胞。目前，自體來源骨髓干細胞，脂肪源性干細胞，新生兒相關來源干細胞對患者來說承擔的風險相對較大，手術復雜，且獲得細胞數量較少，而骨骼肌來源的干細胞比較容易獲取，可直接自活體取材，在局部麻醉下便可進行，具有取材方便，不影響活體組織和功能，免疫原性低和移植后存活時間長等優點。骨骼肌來源的干細胞根據其分子表型和生物活性的不同可分為肌源性干細胞(muscle derived stem cells, MDSCs)、肌衛星細胞和側群(side populations，SP)細胞[8]。體外培養肌源性干細胞常被用作基因載體和組織工程方面的實驗研究[9]。

1.1 肌衛星細胞

肌衛星細胞是最早發現的骨骼肌來源的干細胞，位于肌膜和基膜之間，為體積較小的扁平或立方形細胞；正常情況衛星細胞處于相對靜止狀態，靜止期的肌衛星細胞不表達定向成肌細胞的標志，如：Myf5、MyoD、myogenin、Myf4、bcl-2提示衛星細胞與定向成肌細胞不同，它可能是多潛能干細胞。研究報道至少有兩群衛星細胞存在于骨骼肌，且體內外的行為及特征均不相同[10]。在特定的損傷、變性、鍛煉或牽拉等應激條件、微環境或調節因子作用下，促使靜止期的肌衛星細胞可以被激活進入分裂、增殖期產生成肌前體細胞，原來廣泛分布的肌衛星細胞向受損區遷移并被激活，進行有絲分裂，隨后細胞之間相互融合或與受損肌纖維末端融合，融合后的細胞即開始合成收縮蛋白，并進一步分化、融合形成肌管，參與骨骼肌的修復。

1.2 MDSCs

MDSCs是從骨骼肌中分離出的一類成體多能干細胞,屬于成體干細胞的一種，不屬于間充質組織和肌源譜系，具有多細胞系分化和自我更新能力[11]。通過誘導刺激，MDSCs可以分化為脂肪、骨骼、軟骨、平滑肌、神經和血液細胞等多種細胞和組織類型[12]。它表達干細胞的相關標記：Sca-1，bcl-2，CD34及肌細胞相關標記：desmin, myogenin等。MDSCs分為2類主要亞群，即CD45+MDSC和CD45-MDSC。從正常肌肉分離的CD45+MDSC在體內外實驗中表現出非常有限的生肌潛力，但它們有高度的造血潛力。相反，CD45-MDSC 在體內外實驗中容易分化為生肌細胞，并且也能分化為其他譜系細胞，如血細胞[13]。研究[13,14]顯示MDSCs具有免疫豁免性，抗原性極低，移植試驗中能避免如衛星細胞移植后早期死亡的問題，存活率更高，再生修復骨骼肌的能力比衛星細胞更強。目前，MDSCs與衛星細胞的關系尚未完全明確，以上事實似乎說明CD45-MDSCs是衛星細胞的前體細胞，向衛星細胞分化的同時逐漸獲得衛星細胞表型標志。

1.3 SP細胞

Lin等[15,16]采用Hoechst染色肌細胞的熒光激活細胞分離術(fluorescence activated cell sorting, FACS)從骨髓中純化造血干細胞，造血干細胞具有拒染熒光染料Hoechst33342的特性。隨后，他們用相同的方法在骨骼肌中也分離到能夠分化為各種血細胞的MDSCs，又叫SP細胞，這些SP細胞也具有拒染熒光染料Hoechst33342的特性，其特異的細胞表面抗原為CD33、CD133，且表達造血干細胞的表面抗原CD45[11]。衛星細胞在體外培養時融合為肌管，而SP細胞體外培養時卻形成17,21-Hydroxyprogesterone克隆，提示兩者不同[9]在活體，全身系統用藥后SP細胞可以融合肌纖維，將SP細胞移入受損的肌肉中，SP細胞可進一步分化成Myf5+的生肌細胞[11]。Frank等[10]研究顯示SP細胞高表達BMP4，BMP4可誘導其受體BMP 受體1a (BMPR1a)的增殖，促使SP細胞轉化為肌細胞，MDSCs高表達其拮抗體Gremlin，而且在相同的誘導分化條件下，兩者的增殖分化情況也截然不同，說明SP細胞和MDSCs是不同的細胞系，這些SP細胞已被包括腦、心、肺、脾、腎、小腸和骨骼肌在內的各種活體組織中證實。

2 SUI的骨骼肌干細胞治療

盆底各種肌肉、韌帶的正常功能對維持正常的排尿活動有重要作用，尿道括約肌是維持尿道正常功能的關鍵結構，正常情況下，腹壓增加時，盆筋膜周圍與盆筋膜腱弓相連的肛提肌收縮，拉緊尿道周圍的組織——吊床結構，尿道被壓扁，使尿道內壓能有效抵抗升高的腹壓而控制排尿；如果其支持結構的“吊床”被破壞，膀胱產生過度活動，腹壓增加時，尿道不能閉合而增加抗力，就會發生SUI。傳統的注射療法是經尿道或經陰道將填充材料注入膀胱頸、尿道近段或中段的尿道旁組織中，使尿道腔縮小、變窄或拉長，以增加流出道的阻力，延長功能性尿道的長度，起到關閉尿道內口和后尿道的作用，但遠期填充效果欠佳，易復發。干細胞尿道周圍注射不僅能達到上述效果，而且遠較其他材料持久性強，能改善盆底肌和尿道平滑肌收縮功能，增加盆底支持力和尿道平滑肌阻力，重建盆底組織功能；還能作為肌源性纖維的來源分裂融合為肌纖維，分泌各種生長因子，促進局部神經及肌肉組織再生，增加尿道黏膜和括約肌厚度的作用[17～19]，使尿道周圍肌肉增生增加尿道阻力，改善下尿路肌肉本身的功能，從解剖功能上修復括約肌功能障礙[6,20]，療效較注射無生物活性填充材料明顯提高。

2.1 骨骼肌干細胞動物治療模型

Chermansky等[20]報道注射MDSCs可修復受損的大鼠橫紋肌尿道，將MDSCs注射到尿道周圍，于2、4、6周后分別檢測大鼠泄漏點壓力(leak point pressure，LPP)，并行大鼠橫紋肌免疫染色,結果顯示注射的MDSCs被發現已整合到受損尿道的肌肉層,更重要的是，MDSCs注射組LPP[2周：(38.2±2.2)cm H2O，4周：(43.1±2.6)cm H2O，6周(51.5±0.9)cm H2O]較造模組LPP顯著提高[2周：(17.2±1.4)cm H2O，4周：(26.9±1.9)cm H2O，6周：(25.5±1.3)cm H2O]，且不影響膀胱功能，恢復了損壞的括約肌的功能。Kwon等[21]采用大鼠SUI模型，比較3組不同細胞(MDSCs組，成纖維細胞組及二者混合組)尿道注射療法的效果，雖然各組的短期LPP均明顯升高，但在恢復尿道肌肉收縮功能方面MDSCs組(4.67±0.43)mN/mg明顯優于成纖維細胞組(3.04 ±0.15)mN/mg。

不僅如此，骨骼肌干細胞移植后在體內微環境的作用下還可分化成其他類型細胞，還可促進組織神經再生[19]。Xu等[22]報道在陰部神經切斷的大鼠中移植具有生物降解作用的纖維蛋白膠和MDSCs混合物，結果顯示纖維蛋白膠促進移植的MDSCs修復，干細胞分泌神經生長因子(nerve growth factor，NGF)以促進神經的再生。Delo等[23]分別取2周，3、24個月的小鼠骨骼肌細胞進行體外培養，觀察骨骼肌細胞生長與年齡的關系，結果顯示骨骼肌細胞隨著年齡的增加其功能會逐漸減退，體外培養的倍增時間分別為(41.2±6.7)h,(67.3±10.3)h，(88.1±18.9)h；各年齡組表達血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的細胞，收縮功能均高于同組VEGF陰性的干細胞，但差異無統計學意義。

2.2 自體骨骼肌干細胞治療

Strasser等[17]報道42例女性SUI和21例男性SUI經尿道注射自體上臂骨骼肌干細胞和成纖維細胞，注射量為2.5 ml，隨訪12個月，39例女性和11例男性生活質量評分術前(51.38±10.36) 分，術后(104.06±6.839) 分(P<0.0001)，尿道和括約肌厚度術前(2.103±0.371)mm，術后(3.303±0.297)mm(P<0.0001)，括約肌收縮力術前(0.56±0.246) mm，術后(1.462±0.354) mm(P<0.0001)；與28例注射膠原蛋白的患者相比，術后患者生活質量評分(incontinence quality of life ,I-QOL)中位數明顯提高[106.38 分vs. 99.43 分,P<0.0001]，括約肌收縮力中位數明顯提高[1.57 mm vs. 1.24 mm,P=0.003]，治療SUI更有效。 Mitterberger等[18]選擇123例女性SUI超聲引導下尿道黏膜下自體骨骼肌干細胞和成纖維細胞移植，平均隨訪1年，術后下列評分均有顯著提高：I-QOL[中位數51分(27～70分)vs. 中位數108分(29～110分)，P<0.001]，尿道厚度[(3.5±0.8)mm vs. (4.9±0.9)mm，P<0.001]，尿道括約肌厚度[(2.1±0.3)mm vs. (3.4±0.4)mm，P<0.001]，尿流率[(21.6±9.1)ml/s vs.(25.2±8.1)ml/s,P<0.001]，逼尿肌壓力[(36.6±25.7) cm H2O vs.(31.2±16.7)cm H2O，P<0.001]，靜息時尿道閉合壓 [(28.8±12.3) cm H2O vs.(40.5±15.8) cm H2O，P<0.001]，自主收縮尿道時尿道閉合壓[(51.8±35.8) cm H2O vs.(78.1±56.2) cm H2O，P<0.001]；但最大殘余尿無顯著差異[(425.9±129.6)ml vs.(450.5±118.0)ml,P>0.05]。

Carr等[24]采用經尿道注射MDSCs(細胞數:18×106～22×106)治療8例SUI，平均隨訪1年，其中3例在治療1個月后退出隨訪，剩余5例治愈的中位數時間為10個月，其中2例在治療后3～8個月尿墊重量較治療前減輕50%，并在第1次注射后4～8個月接受了二次注射，1例治愈，至隨訪終止時未再出現尿失禁，5例治療及隨訪期間均無嚴重的不良事件發生。Stangel-Wojcikiewicz等[25]報道16例SUI行MDSCs治療，均在自體上臂肌肉活檢分離出MDSCs(細胞分離后在體外擴增8～10周，細胞數0.6×106～25×106)，在內鏡引導下經尿道注入尿道括約肌周圍9、12、3點的位置，體外培養的自體MDSCs在相差顯微鏡下均呈現均勻的細長形態，免疫組化結蛋白(+)，另外，肌細胞生成素的mRNA和MYHC-2A蛋白在體外擴增的細胞中均可見表達；隨訪2年，75%患者生活質量評分顯著改善(其中50%患者完全改善，25%患者部分改善)；患者肌肉活檢及注射部位均無出血或感染，無形態變化及致瘤，無排尿障礙，尿潴留及尿路感染，無嚴重不良事件發生，這表明MDSCs治療女性SUI的前景是令人鼓舞的。Carr等[26]報道對38例女性SUI行自體股四頭肌來源的MDSCs注射治療SUI，分為低劑量組(細胞數1×106,2×106,4×106,8×106或16×106)及高劑量組(細胞數32×106,64×106或128×106)，治療1，3，6，12個月后24 h漏尿重量，尿失禁和生活質量評估結果：33例完成此研究，高劑量組與低劑量組相比，漏尿重量減輕超過50%[88.9%(8/9) vs. 61.5%(8/13)]，膀胱功能改善[77.8%(7/9) vs. 53.3%(8/15)]，3 d內漏尿≤2次[88.9%(8/9) vs. 33.3%(5/15)均有顯著改善，差異有統計學意義。治療相關的并發癥多數為痛經，盆、腹腔疼痛，活檢、穿刺部位瘀傷，感染，尿失禁加重，排尿困難等，其中盆、腹腔疼痛(10.5%,4/38)，活檢和注射部位瘀傷(7.9%,3/38)發生率較高，無重大不良事件。幾乎所有活檢和注射手術相關的不良事件可通過臨床治療好轉或痊愈[26，27]。

盡管干細胞的相關基礎研究已取得長足進步，但在臨床治療中干細胞研究還面臨諸多問題，如干細胞的起源及其最佳的分離純化方法，如何保持干細胞的原始特征及可塑性條件下進行大量擴增，以獲得臨床治療所要的細胞數量；對干細胞的分化機理也還不清楚，無法對其定向分化進行精確調控，其致瘤性，移植后的安全性需臨床長期、大樣本研究，相信隨著干細胞研究的深入，將為盆底功能障礙疾病的治療帶來新的曙光。

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(修回日期：2015-04-08)

(責任編輯：李賀瓊)

Progress on Treatment of Stress Urinary Incontinence with Skeletal Muscle-derived Stem Cells

WangWenli,DuanHua.

MinimallyInvasiveCenter,BeijingObstetricsandGynecologyHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100006,China

Correspondingauthor:DuanHua,E-mail:duanhua888@163.com

【Summary】 There are a variety of treatment methods for stress urinary incontinence (SUI). Surgery is effective but has high risks, only to adapt to the limited population. Conservative treatment has a high recurrence rate and poor long-term results. Local injection of stem cell has been proposed as a new minimally invasive therapy of SUI. Stem cells, with the ability to transform into muscle cell, secrete various growth factors, promote local nerve and muscle tissue regeneration, and repair sphincter dysfunction. This article reviewed on therapy of skeletal muscle-derived stem cells and the associated risks of treatment.

Stress urinary incontinence; Stem cells; Nerve fibers

R694+.54

A

1009-6604(2015)06-0563-04

10.3969/j.issn.1009-6604.2015.06.024

2014-08-04)

* 通訊作者：E-mail：duanhua888@163.com