北京市一些地區生肉標本中單增李斯特菌的分離及其分子流行病學特征分析

馬愛靜，王 艷，王 毅，李東迅,許華青,袁雪嬌，劉 凱，葉長蕓

北京市一些地區生肉標本中單增李斯特菌的分離及其分子流行病學特征分析

馬愛靜1，王 艷1，王 毅1，李東迅2,許華青3,袁雪嬌1，劉 凱1，葉長蕓1

目的 了解北京市一些地區生肉中單增李斯特菌的污染情況及其分子流行病學特征。方法 采用北歐食品分析標準(NMKL)對北京市一些地區采集的340份牛、羊、豬、雞和鴨生肉標本進行單增李斯特菌的分離鑒定，并對分離菌株進行血清學分型(Serotyping)、脈沖場凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)分型及多位點序列分型(Multilocus Sequence Typing, MLST)分析。結果 生肉標本中單增李斯特菌污染率為6.2%(21/340)。分離菌株含3種血清型(1/2a，1/2b和1/2c)，以1/2c為優勢血清型(占47.6%)。PFGE分析中，使用內切酶AscI酶切電泳將21株單增李斯特菌分為12個型別，可聚類為3個群。MLST分析將21株單增李斯特菌分為7個ST型，其中 ST9型最多(10株)。結論 北京市一些地區的生肉類食品中存在6.2%的單增李斯特菌污染率，這些單增李斯特菌以家系II菌株占據絕對優勢(80.1%)，其中1/2c型，GX6A16.CN0004和ST9型分別為血清型、PFGE帶型以及MLST序列型的優勢型別，與我國食源性單增李斯特菌的優勢菌群特征一致。

單增李斯特菌；血清型分型；脈沖場凝膠電泳分型；多位點序列分型

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)屬于李斯特菌屬，是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性短桿菌，不形成芽孢和莢膜[1]。該菌在生冷食品和環境中廣泛存在，可侵襲人和哺乳動物細胞，導致人類和動物的李斯特菌病[1-2]。李斯特菌的易感人群為孕婦、新生兒、老人以及免疫低下的人，可導致發熱性胃腸炎、敗血癥、腦膜炎、流產等，死亡率較高[3-4]。自1929年丹麥首次報道人類感染性李斯特菌病后，該菌引起的感染病例呈上升趨勢[1]。1981年加拿大沿海省份的一起李斯特菌病的暴發證實單增李斯特菌可通過食物在人群中傳播[5-6]。1983-2011年間，美國、加拿大、歐洲相繼報道了12起李斯特菌病的暴發[7-18]。單增李斯特菌也被世界衛生組織列為重點監測的食源性病原菌之一[19]。我國于2000年建立了包括單增李斯特菌在內的全國食源性致病菌監測網。

研究顯示，食入被單增李斯特菌污染的食品是目前引起人類李斯特菌病暴發和散發的重要因素[20-21]。為了解生肉類食品中單增李斯特菌的污染情況及菌株的分子流行病學特征，本研究采集了北京市一些地區農貿市場及超市的生肉類食品(豬、牛、羊、雞、鴨肉)，對其進行單增李斯特菌的檢測，并對分離到的菌株進行血清學、PFGE以及MLST分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 自2013年11月-2014年4月從北京市不同農貿市場及超市共采集340份生肉類樣品(牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉)，為了使樣本具有充分發散性，采樣時將同一采樣時間、同一攤位、同種類且來自同一切割部位的生肉記為一份樣本，具體信息見表1。

1.1.2 參考菌株 單增李斯特菌參考菌株EGD-e購自美國標準生物品收藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)，作為單增李斯特菌陽性對照菌株，由本實驗室保存。

1.1.3 試劑 FRASER BROTH BASE、BRILLIANCETMLISTERIA AGAR BASE培養基購自英國OXOID公司；腦心浸液購自北京陸橋技術有限公司；2×TaqMasterMix購自北京康為世紀公司；APIListeria生化試劑條購自法國bioMérieux公司；Goldview DNA染料、DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司；PCR引物合成、PCR產物純化及測序由北京天一輝遠生物科技有限公司完成。

1.1.4 主要儀器 Labcycler PCR儀購自德國圣歐國際有限公司；電泳槽購自北京博思公司，Gel Doc XR 凝膠成像儀購自美國伯樂公司；脈沖場凝膠電泳儀為CHEF DRIIIsystem(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像系統為Gel Doc XR+ System(美國Bio-Rad公司)；水浴搖床為Grant OLS2000(英國Grant公司)；濁度儀為Densimat(法國BioMérieuxVitek公司)。

1.2 方法

1.2.1 單增李斯特菌的分離培養 參照北歐食品分析標準(NMKL)中單增李斯特菌的分離方法：稱取25 g不同生肉標本接種至225 mL增菌液(Half Fraser’s broth, Oxoid, Hampshire, UK)，30 ℃、220 r/min恒溫搖床培養24 h。取1 mL增菌液將其接種至10mL Fraser增菌液中，37 ℃、220 r/min恒溫搖床培養48 h。取10 μL Fraser增菌液接種至李斯特菌固體顯色培養基上，37 ℃培養24～36 h，挑取可疑菌落(周圍有透明暈環的藍色菌落)接種至腦心浸液固體培養基傳代兩次進行純化。

1.2.2 菌株鑒定 刮取適量純培養物至100 μL無菌去離子水中振蕩混勻，100 ℃沸水中煮10 min，12 000 r/min離心5 min，收集上清，-20 ℃保存備用。提取核酸后用李斯特菌屬及單增李斯特菌的種特異性引物進行PCR擴增初步鑒定[22]。對擴增結果為陽性的分離菌，采用APIListeria生化鑒定試劑條進行單增李斯特菌種水平的鑒定。

PCR反應體系(20 μL)：2×Taq Master Mix 10 μL、無菌蒸餾水7 μL、上下游引物(10 μmoL/μL)各1 μL、模板DNA 1 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30個循環；最后72℃延伸10 min。PCR反應結束后取6～8 μL擴增產物上樣于2.0%瓊脂糖凝膠(陽性參考菌株擴增產物作為對照)，220 V電泳20 min，使用凝膠圖像分析系統讀取結果。

1.2.3 血清型鑒定 對所有分離得到的單增李斯特菌，采用日本Denka Seiken公司的血清抗體，按照產品說明書進行血清型鑒定。

1.2.4 脈沖場凝膠電泳分型(PFGE)分析 根據美國CDC PulseNet的標準操作規程對單增李斯特菌進行脈沖場凝膠電泳分型分析。選用限制性核酸內切酶AscI對菌株進行酶切電泳，PFGE圖像用BioNumerics(Version5.0)軟件根據UPGMA(Unweighted Pair Group Method using Arithmetic averages)方法進行聚類分析。

1.2.5 多位點序列分型(MLST)分析 單增李斯特菌的多位點序列分型分析方法參照法國巴斯德研究所的單增李斯特菌多位點序列分型數據庫操作流程(http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Lmono.html)，選擇7個管家基因(abcZ,blgA,cat,dapE,dat,ldh,lhkA)部分片段序列進行PCR擴增[23]。PCR產物經純化后，進行雙向測序。測序結果分析時，用SeqMan II(DNAStar Inc., Madison, WI, USA)軟件并結合菌株等位基因的正反向序列圖譜對等位基因序列進行拼接和校正，將整理好的序列與單增李斯特菌MLST數據庫進行比對，確定每個管家基因的序列號。7個管家基因序列號的組合即為該菌株的ST型。采用BioNumerics軟件將本研究分離的21株單增李斯特菌株和其他不同ST型別的中國單增李斯特菌株[24]構建最小生成樹,見圖2。

2 結 果

2.1 菌株分離情況 本實驗采集的340份標本共分離到21株單增李斯特菌，陽性率為6.2%。其中8株分離自雞肉，分離率為22.2%；6株分離自牛肉，分離率7.5%；6株分離自豬肉，分離率為5.0%；1株分離自羊肉，分離率為1.1%。不同食品樣品中單增李斯特菌的分離情況詳見表1。

2.2 血清型分型 21株單增李斯特菌分為3種血清型(1/2a，1/2b和1/2c)，主要血清型為 1 /2c和1 /2a，分別有10株(47.6%)和7株(33.3%)，1/2b血清型有4株(19.0%)(表1)。

2.3 PFGE分型 21株單增李斯特菌使用AscI酶切電泳后分為12種PFGE型別(GX6A16.CN0004,GX6A16.CN0009,GX6A16.CN0011,GX6A16.CN0018,GX6A16.CN0019,GX6A16.CN0029,GX6A16.CN0030,GX6A16.CN0046,GX6A16.CN0054,GX6A16.CN0192,GX6A16.CN0254,GX6A16.CN0284)，見圖1。其中GX6A16.CN0004為主要型別(7株)。采用BioNumerics進行菌株間聚類分析，可將21株菌的12種PFGE帶型分為3個群，各群包含菌株數不等，其中群I菌株數最多，包括15株菌(5株1/2a型，10株1/2c型)。群II包含4株菌，其中3株為ST87，1株為ST3，血清型皆為1/2b。群III包括2株菌，皆為ST155型，1/2a血清型(圖1)。

2.4 MLST分型 經MLST分型分析，21株單增李斯特菌分為7個ST型，包括10株ST9型、3株ST87型、2株ST155型、2株ST101型、2株ST121型、1株ST8型、1株ST3型，其中ST9型為優勢ST型(見表1、圖1)。最小生成樹結果顯示，本研究中所分離到的單增李斯特菌株皆分布于我國已報道的單增李斯特菌主要克隆群[24]，且分別屬于家系I和家系II。

注：*將本研究所分離的21株單增李斯特菌使用內切酶AscI進行PFGE分析，并根據UPGMA方法進行聚類分析。相應的菌株名稱、PFGE型別、菌株來源、ST型別以及血清型見圖右側。

*The 21L.monocytogenesisolates from this study were analyzed by PFGE usingAscI. The dendrogram were constructed using UPGMA. The corresponding isolate, pulse types, source, STs and serotypes were shown alongside the dendrogram on the right.

圖1 21株單增李斯特菌的PFGE聚類圖、ST型和血清型

Fig.1 Dendrogram of PFGE patterns, MLST types and serotypes of 21L.monocytogenesstrains

注：*每個圓圈中的數字據代表一種ST型，圓圈大小代表菌株數量，圓圈周圍的陰影區域表示區域內的ST型屬于同一克隆群(Clone complex，CC)。圓圈內不同的顏色表示不同L.monocytogenes來源。

* Each circle corresponds to a sequence type. The size of the circle is proportional to the number of the isolates. The shadow zones in different color correspond to different clonal complexes, and the color within the cycles represents the sources of theL.monocytogenes.

圖2 基于MLST型別的遺傳進化分析

Fig.2 Genetic relationship of the isolates based on MLST

3 討 論

單增李斯特菌作為李斯特菌屬中對人致病的菌種，可以侵入宿主細胞，導致李斯特菌病，致死率較高，且在食品中污染較為嚴重[1,7-8,25]。本次調查的生肉類食品中單增李斯特的污染率為6.2%，且在生牛肉、生羊肉、生雞肉、生豬肉中均檢出單增李斯特菌，以雞肉的污染率相對較高。顯示生肉類等食品中存在明顯的單增李斯特菌污染現象，因此食品行業中此類生肉質食品加工過程中一定要注意與熟食分開，避免直接食用被單增李斯特菌污染的熟食。本研究中的牛肉、羊肉、豬肉、雞肉中單增李斯特菌的檢出率低于崔京輝等于2004～2006年對北京市西城區生肉中單增李斯特菌的檢出率[25]，分析可能與本次調查的采樣時間為冬春季節，氣溫較低不利細菌生存繁殖有關。

本研究中分離出的21株單增李斯特菌血清型主要為1/2c，其次為1/2a型，而部分西方國家單增李斯特菌則為1/2a型占有絕對優勢，1/2c血清型則相對較少[26]。表明我國食源性單增李斯特菌的血清型別組成與其他國家有所差異。PFGE分型分析可以反映出菌株核酸間的相似度，因而可作為暴發時菌株溯源的依據。本研究中所分離的單增李斯特菌株PFGE型別以GX6A16.CN0004為優勢型別，與我國食源性單增李斯特菌的優勢型別一致[24]。多位點序列分型分析發現，本次調查中所分離的菌株，以ST9型為主，其血清型皆為1/2c。從最小生成樹可以看出這些菌株主要集中在家系I和家系II(圖2)。PFGE結果聚類分析顯示，群II所含菌株包括ST3和ST87兩個型別(圖1)，血清型均為1/2b，是引起人類李斯特菌病的常見血清型，這4株菌均從雞肉中分離獲得，應對此污染現象加以重視。21株分離株中有6株菌的PFGE、MLST以及血清型結果均相同，這些菌株分別來自同一地區豬肉、牛肉、雞肉3種不同的生肉樣本，且采樣時間為同一天。由于部分標本采集的背景信息不完整，無法確定這幾株菌是否是來自于同一超市或者市場(及攤位)的標本，推測可能部分市場或者超市的各種生肉食品存在相同的污染來源，或者同一超市或市場生肉食品間存在交叉污染的可能性。因此各超市或者市場中不同生肉食品的分類儲存很有必要。

單增李斯特菌作為重要的食源性病原菌之一，得到了WHO 和各國的高度重視。美國將單核細胞增生李斯特菌列為7種主要食源性致死病原菌之一，由此菌引起的李斯特菌癥病例呈上升趨勢[19]。我國自2000年建立全國食源性致病菌監測網以來，對單增李斯特菌的監測力度逐年加大。本次研究結果顯示，單增李斯特菌在生禽畜肉類食品中存在不同程度的污染，應當加強對生肉類食品的生產及銷售環節的病原學監測，以預防食源性李斯特菌病的發生，降低暴發感染的風險。

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Molecular epidemiological characteristics ofListeriamonocytogenesisolated from raw meat samples in some regions of Beijing, China

MA Ai-jing1,WANG Yan1,WANG Yi1,LI Dong-xun2,XU Hua-qing3,YUAN Xue-jiao1,LIU Kai1,YE Chang-yun1

(1.State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China;2.Department of Microbiology, Medical College of Guiyang, Guiyang 550004, China;3.Department of Dermatology, the Sixth People’s Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou 450000, China)

Listeriamonocytogenes(L.monocytogenes) is one of the most significant human pathogenic bacteria, as it causes serious invasive illnesses and is mainly transmitted through the food chain. Thus, an epidemiologic study, which investigates the prevalence and molecular characteristics of this pathogen involving raw materials contamination, is extremely required to ensure food safety, evaluate the potential health risk, and provide the control strategies. A total of 340 raw meat samples, including pork, beef, lamb, chicken and duck products, were collected from several local markets in Beijing, and theNMKLNo. 136 method was selected for the isolation ofL.monocytogenesfrom various raw meat samples. Then, the serological classification, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) analysis and multi-locus sequence typing (MLST) were performed to provide the valuable strain discrimination. Among 21 strains ofL.monocytogenesisolated, accounting for 6.2% (21/340) contamination rate, three serotypes were detected and distinguished, including serovars 1/2a (7), 1/2b (4) and 1/2c (10), and the serotype 1/2c accounted for 47.6% of all isolates. The PFGE typing byAscIdivided the 21 isolates into 12 pulse types (PTs) that were assigned to 3 clusters. The result of MLST showed 7 different sequence types and the predominant STs was ST9 (10). Accordingly, the food sources contaminated byL.monocytogeneswas confirmed in Beijing by our study, and serotype 1/2c, GX6A16.CN0004 and ST9 were the predominant serotype, pulse type and sequence type, respectively. The result of molecular subtypes indicated that common serotypes, PTs and STs in Beijing had the similar prevalent trends as that in rest of China.

Listeriamonocytogenes; serotype; PFGE; MLST

Ye Chang-yun, Email: yechangyun@icdc.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.05.003

國家重大傳染病防治科技重大專項(No.2011ZX10004-001,No.2013ZX10004-101)聯合資助

葉長蕓，Email：yechangyun@icdc.cn

1.傳染病預防控制國家重點實驗室，中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，北京 102206； 2.貴陽醫學院微生物學教研室，貴陽 550004； 3.鄭州市第六人民醫院皮膚性病科，鄭州 450000

R378

A

1002-2694(2015)05-0403-05

2015-01-05；

2015-03-16

Supported by the National Major Science and Technology Project of Prevention and Control in Significant Infectious Disease (Nos. 2011ZX10004-001 & 2013ZX10004-101)