副溶血性弧菌Vop T蛋白的表達及其抗體的毒力菌株特異性研究

楊振泉，饒勝其，高 璐，薛 峰，李 平，方維明，焦新安

副溶血性弧菌Vop T蛋白的表達及其抗體的毒力菌株特異性研究

楊振泉1,3，饒勝其1，高 璐1，薛 峰2，李 平1，方維明1，焦新安3

目的 研究副溶血性弧菌VopT蛋白的菌群特異性，為建立致病性副溶血性弧菌的快速檢測方法以及探討VopT的作用機制奠定基礎。方法 根據副溶血性弧菌VopT蛋白基因(VPA1327)序列設計合成引物，通過PCR從副溶血性弧菌致病株WX06152(血清型O3∶K6)中擴增出目的基因，構建原核表達載體pET-30a(+)-VPA1327并轉化大腸桿菌BL21(DE3)。經IPTG誘導表達，重組蛋白應用MALDI-TOF-MS/MS鑒定和His鎳柱純化，并通過免疫BALB/c小鼠制備抗血清，建立副溶血性弧菌VopT蛋白的間接ELISA檢測方法，并分析其敏感性和毒力菌株特異性。結果 成功表達了大小為33 kDa融合蛋白，肽指紋圖譜與副溶血性弧菌VopT蛋白一致。重組VopT抗血清能夠特異性檢測副溶血性弧菌毒力株的全菌細胞及其裂解蛋白，與環境株及其它種屬菌株無明顯交叉反應，靈敏度達到105CFU·mL-1。結論 重組VopT的抗血清具有良好特異性，為探討VopT致病機理和分泌機制研究提供了一定的參考依據。

副溶血性弧菌；VopT蛋白；原核表達；多克隆抗體；特異性

Supported by the Jiangsu Province Science and Technology Support Program (No. BE2013733) and the North Jiangsu Science and Technology Development Project (No. BC2013438)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)廣泛分布于海水環境和海產品中，流行病學研究顯示Vp引起的食源性疾病呈世界性分布，目前已經成為沿海國家和地區面臨的重要公共衛生問題之一[1]。研究表明95%以上的環境分離株不具有致病性[2]，盡管耐熱性直接溶血素(Thermostable Direct Hemolysin，TDH)以及耐熱相關溶血毒素(Thermostable Related Hemolysin，TRH)被公認的致病性副溶血性弧菌主要的毒力標志物，基于這兩個蛋白及其編碼基因(tdh和trh)的生化及分子方法已被用于副溶血性弧菌毒力株的體外檢測，但是近年來流行病學調查發現副溶血弧菌的臨床分離菌株中存在少數不含有tdh和trh基因，顯示了流行株還存在新的分子特征的菌群[3]。

VopT是一種具有ADP-核糖基轉移酶活性的效應蛋白[4]，它的編碼基因(VPA1327)位于副溶血性弧菌染色體Ⅱ的毒力島上。這種蛋白與綠膿假單胞菌T3SS分泌的雙功能細胞毒素ExoT和ExoS的ADPRT結構域分別具有45%和44%的同源性，并且VopT基因敲除能夠使副溶血性弧菌毒力株的細胞毒性顯著減弱，顯示該基因與菌株致病性具有密切關系[5]。另一方面，VPA1327基因片段顯示了良好的毒力菌株特異性，是副溶血性弧菌毒力菌株檢測的潛在分子靶標[6]，但其編碼產物VopT的作用機制、菌群特異性及其在致病菌株快速檢測中的應用仍有待深入研究。本研究對副溶血性弧菌大流行株Vop T的編碼基因VPA1327進行表達和多克隆抗體制備，建立了副溶血性弧菌VopT的ELISA檢測方法，并驗證了Vop T的毒力菌株特異性，為進一步探討VopT的作用機制提供了新參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 副溶血弧菌WX06152(tdh陽性，血清型O3∶K6)為揚州大學食品微生物實驗室保藏；E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)以及表達載體pET-30a(+)為揚州大學江蘇省人獸共患病重點實驗室保存；限制性內切酶BamHI和Xhol、T4 DNA 連接酶、Taq酶、dNTPs、DNA Marker、PCR產物純化試劑盒、UNIQ-10柱式DNA凝膠回收試劑盒購自上海生物工程股份有限公司；BALB/c小鼠購自揚州大學比較醫學中心；酵母浸出粉、胰蛋白胨、IPTG等生化試劑購自北京奧博星生物技術開發有限責任公司，所有化學試劑均為國產分析純。引物合成及基因測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 表達載體構建 副溶血弧菌基因組DNA的提取參考文獻[7]所述方法進行。依據GenBank中副溶血弧菌VPA1327基因序列和表達質粒pET-30a (+)上的多克隆位點設計引物，上游引物VPA1327-F (P1) 為5′-GAAGGATCCGTGAAGGTTTGTAGAATACA-3′，5′端添加BamHI酶切位點；下游引物VPA1327-R (P2)為5′-GAACTCGAGTCACTTAGCTAAATCTAGCG-3′，5′端添加Xhol酶切位點。25 μLPCR擴增體系為：模板(50 μg/mL)1 μL； dNTP(10 mmol/mL)0.5 μL；上游引物 (50 pmol/ μL)0.5 μL；下游引物(50 pmol/ μL)0.5 μL；10×Buffer 2.5 μL；MgCl2(2 mmol/L)2 μL；Taq酶(5 U/μL)0.5 μL；ddH2O 17.5 μL；PCR反應的循環參數為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 cycles，72 ℃再延伸10 min。

采用常規分子克隆技術，將VPA1327基因的PCR擴增產物與表達載體pET-30a(+)分別進行BamHI和Xhol雙酶切，膠回收目的片段及酶切后的表達載體，采用T4 DNA連接酶于16 ℃連接過夜，轉化感受態細胞E.coliBL21，于Km+(100 μg/mL)平板上篩選重組子。提取質粒后，采用PCR、雙酶切以及測序鑒定陽性克隆，并用DNAstar軟件對測序結果和GenBank中所報道的序列進行比對分析。

1.3 誘導表達及表達產物鑒定 將鑒定結果為陽性的重組質粒pET-30a(+)-VPA1327轉化到E.coliBL21(DE3)中。挑取上述陽性克隆接種于5 mL LB(Km+)液體培養基中37 ℃活化過夜，次日以1%接種量接入新鮮的LB( Km+)液體培養基中，37 ℃，200 r/min振蕩培養至OD600 nm為0.5時，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，37 ℃，誘導培養4 h。誘導結束后，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，用PBS重懸沉淀后進行SDS-PAGE電泳分析，同時以宿主菌DE3誘導前、pET-30a(+)/DE3誘導前后以及pET-30a(+)-VPA1327/DE3誘導前的全菌體作為對照。

表達產物的鑒定應用MALDI-TOF-MS/MS進行分析，酶解方法：Trypsin酶解；質譜參數：ABI 4800 MALDI-TOF質譜儀；YAG激光源，波長355 nm，頻率200 Hz；采用陽離子工作反射模式進行MS/MS檢測，離子加速電壓為20 kv；使用標準肽混合物(Angiotensin II Mr1046.5420； Angiotensin I Mr1296.6853；Substance P Mr1347.7361；Bombesin Mr1619.8230； ACTH clip 1-17 Mr2093.0868；ACTH clip 18-39 Mr2465.1990；Somatostatin 28 Mr3147.4714)作為外標校正。

1.4 重組蛋白純化 對于成功表達出重組蛋白的 BL21(DE3)按 1%比例接種后擴大培養，IPTG誘導重組蛋白表達，4 ℃離心收集細胞并洗滌后，冰浴超聲裂解細胞，4 ℃，10 000 r/min離心20 min，收集包涵體并用1% Triton X-100洗滌后，用變性液(1 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris-HCI，pH 8.0，8 mol/L尿素，5%甘油)溶解，接著用變性液平衡過的Ni-NTA柱進行親和層析，先用含50 mmol/L 咪唑的變性液充分洗去雜蛋白后，再用含300 mmol/L咪唑的變性液洗脫目標融合蛋白。將Ni-NTA柱純化后收集的目標蛋白溶液裝入透析袋(截留分子量10 kDa)，放入復性緩沖液中，于4 ℃磁力攪拌(轉速150 r/min)，進行尿素濃度梯度透析。透析復性液為：25 mmol/L Tris-HCl (pH 7.3)，0.15 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1.5 mmol/L GSH，0.3 mmol/L GSSG，5%甘油，0～6 mol/L尿素。每隔8 h換一緩沖液，依次為含6 mol/L、4 mol/L、2 mol/L與0 mol/L尿素的復性液，最后對含0.9% NaCl的生理鹽水(pH 7.3)進行透析。用SDS-PAGE分析純化復性后的目標蛋白，并用灰度掃描軟件分析蛋白純度。

1.5 多克隆抗體制備 取10只6周齡的BALB/c小鼠，將表達蛋白產物用PBS稀釋成3 mg/mL，首次免疫將蛋白與弗氏完全佐劑以1∶1的體積比混合，充分乳化后，每只小鼠經腹部皮下注射400 μL；分別于首次免疫后的第3和第5周進行加強免疫, 每次用3 mg/mL表達蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混合，充分乳化后，對小鼠進行腹部皮下注射，每只小鼠經腹部皮下注射400 μL。取2只BALB/c小鼠以PBS和弗氏完全佐劑混合作為抗原免疫，作為陰性對照，免疫程序同上。第3次免疫后第10 d眼眶采血，分離血清，于-20 ℃保存備用?？寡宓男r采用間接ELISA方法檢測，分別以經超聲處理(200 W，持續10 s，間隔5 s，共10次)的副溶血弧菌裂解蛋白和重組蛋白為抗原包被酶標板，以未經免疫的鼠血清作為陰性對照，根據反應結果確定抗體的效價。

1.6 抗血清反應性和敏感性試驗 抗血清對副溶血性弧菌的反應性和敏感性的通過間接ELISA方法檢測。包被抗原采用菌株WX06152的細胞、細胞裂解蛋白以及培養物上清。將副溶血弧菌WX06152于37 ℃，150 r/min培養3 h、6 h、9 h和12 h，培養物通過離心分離菌體和培養上清。菌體經過3次洗滌后用PBS制備成108CFU·mL-1的菌懸液。細胞裂解蛋白通過菌懸液超聲處理(200 W，持續10 s，間隔5 s，共10次)后離心收集。將上述組分用PBS緩沖液10倍稀釋后為抗原包被酶標板，每樣設3個平行孔，以1∶400、1∶800和1∶1 600稀釋的抗血清作為檢測抗體，1∶10 000稀釋的HRP酶標羊抗鼠IgG作為二抗，按照間接ELISA程序進行反應，OPD顯色后測定OD492值。陰性對照為同樣稀釋度的陰性血清。陽性血清和陰性血清的比值(P/N)最大的組合作為最佳抗原和抗體的工作濃度，P/N≥2.1判定為陽性。

1.7 抗血清交叉反應試驗 將6株不同來源的副溶血弧菌菌株、溶藻弧菌、哈維氏弧菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌于37 ℃，150 r/min培養12 h，離心收集的菌體細胞，制備106CFU·mL-1的菌懸液，通過超聲處理(參數同1.7)制備菌體蛋白作為包被抗原，以1∶800稀釋的抗血清作為檢測抗體，1∶10 000稀釋的HRP酶標羊抗鼠IgG作為二抗，同樣稀釋度的陰性血清為對照，建立間接ELISA檢測方法。通過比較P/N值檢測抗血清是否具有交叉反應，P/N≥2.1判定為陽性。

2 結 果

2.1 目的基因PCR擴增和表達載體構建結果 根據VopT編碼基因VPA1327序列設計引物VPA1327-F和VPA1327-R，建立優化的PCR體系擴增目的基因，并克隆至表達載體pET-30a(+)的多克隆位點中，結果如圖1所示。結果成功從副溶血性弧菌WX06152株(血清型O3∶K6)基因組DNA中擴增出目的基因片段，片段大小為711 bp，與預期值相符(泳道4)。構建重組質粒pET-30a(+)-VPA1327經BamHI和Xhol雙酶切消化后出現兩條條帶，一條與經雙酶切的空質粒pET-30a(+)大小一致(泳道2)，另一條帶分子量為711 bp，與預期大小一致(泳道1)。重組質粒能夠擴增出目的條帶(泳道3)，大小與基因組模板擴增產物大小一致(泳道4)，而以空質粒模板未擴增出任何條帶(泳道5)。重組質粒進一步應用T7通用引物測序，結果顯示，克隆序列與GenBank中發表的VPA1327序列同源性達100%，且基因沒有發生移碼和突變。以上結果表明目的基因VPA1327已成功克隆入表達載體pET-30a(+)中。

泳道M，DNA分子量標準；泳道1和2，重組質粒和空質粒的酶切產物；泳道3、4和5，重組質粒、基因組DNA以及空質粒的PCR擴增產物；箭頭方向為目的基因條帶(711 bp)。

Lane M: DNA ladder; Lane 1 and 2: enzyme-digested products of recombinant and empty plasmid; Lane 3, 4 and 5: PCR amplicons of recombinant plasmid, genomic DNA and empty plasmid; Arrow means aim gene band (711 bp).

圖1 VopT基因的PCR擴增及表達載體構建結果

Fig.1 Results of PCR amplification of VopT gene and construction of expression plasmid

2.2 重組蛋白的誘導表達與純化結果 將重組質粒pET-30a(+)-VPA1327轉化宿主菌E.coliBL21(DE3)，通過抗性篩選和PCR鑒定成功獲得了重組表達菌pET-30a(+)-VPA1327/DE3。通過IPTG誘導表達后的菌體蛋白進行SDS-PAGE電泳分析，結果如圖2-A所示。重組菌pET-30a(+)-VPA1327/DE3經IPTG誘導培養后在33 kDa處有一條新增蛋白條帶，與預期的融合蛋白分子量大小一致(泳道5)。宿主菌E.coliBL21(DE3)及空質粒載體轉化菌誘導前后，以及未經IPTG誘導的pET-30a(+)-VPA1327/DE3均沒有產生目的條帶。結果表明VPA1327在E.coliBL21(DE3)中經IPTG誘導后能成功表達融合蛋白。誘導后的pET-30a(+)-VPA1327/DE3全菌體經超聲處理后的沉淀和上清分別進行SDS-PAGE電泳分析(圖2-A，泳道6和7)，結果顯示培養上清中不存在重組蛋白，誘導表達的融合蛋白主要以包涵體形式存在于菌體沉淀中。表達產物包涵體經變性液溶解、His鎳柱純化及尿素濃度梯度透析后取樣用SDS-PAGE凝膠電泳鑒定，在33 kDa處出現清晰條帶, 其他蛋白雜帶不明顯(圖2-B) , 經灰度掃描分析蛋白純度大于90%。

2.3 重組蛋白質MALDI-TOF-MS質譜鑒定 重組蛋白質進行割膠回收、脫色和膠內Trypsin酶解，產物應用MALDI-TOF-MS質譜分析，獲得的肽片段質量數據通過蛋白質數據庫Mascot(http://www.matrixscience.com)進行檢索，結果顯示重組蛋白與庫中副溶血性弧菌推測胞外酶VopT序列(VPA1327的編碼產物)的PMF匹配得分最高，達到263，VopT序列相匹配的肽段覆蓋率達61%(圖3)，顯示表達產物的氨基酸序列與副溶血性弧菌VopT蛋白一致。

(A)泳道M，蛋白標樣；泳道1，DE3未誘導細胞；泳道2，pET-30a(+)/DE3未誘導細胞；泳道3，pET-30a(+)/DE3誘導后細胞；泳道4，pET-30a(+)-VPA1327/DE3未誘導細胞；泳道5、6和7分別pET-30a(+)-VPA1327/DE3誘導后全細胞超聲破碎原液、沉淀和上清；(B)泳道M，蛋白標樣；泳道1，純化后蛋白樣

(A) Lane M: molecular marker; Lane 1: DE3 cell without being induced; Lane 2: pET-30a(+)/DE3 cell without being induced; Lane 3: induced pET-30a(+)/DE3 cell; Lane 4: pET-30a(+)-VPA1327/DE3 cell without being induced; Lane 5, 6 and 7: culture, cell and supernant of induced pET-30a(+)-VPA1327/DE3.(B) Lane M: molecular marker; Lane 1: purified recombinant product.

圖2 重組蛋白的表達(A)與純化(B)電泳結果

Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression (A) and purification (B) of recombinant protein

2.4 抗血清反應性和敏感性試驗結果 將純化的VPA1327表達產物免疫6周齡的BALB/c小鼠，加強免疫后眼眶采血并分離抗血清，以陰性血清作為對照，經間接ELISA法檢測抗血清對重組蛋白的效價為1∶25 600。以1∶800稀釋的抗血清作為檢測抗體，建立ELISA法對過夜培養的副溶血性弧菌的全細胞、細胞裂解蛋白以及培養上清的反應性和敏感性進行測定，結果如表1所示。結果顯示抗原的細胞濃度大于105CFU·mL-1時，全菌包被和超聲波裂解產物包被均檢測為陽性(P/N>2.1), 但是以培養上清包被的各個稀釋度均沒有檢出陽性。

2.5 細菌培養時間對檢測的影 利用不同培養時間(3 h、6 h、9 h和12 h)的副溶血弧菌WX06152的全細胞、細胞超聲裂解物以及培養物上清液作為抗原包被酶標板，按照建立的ELISA方法檢測Vop T，檢測結果如圖4所示。結果顯示3 h和6 h培養物的全細胞、細胞裂解物以及培養物上清液中均未檢出Vop T(P/N<2.1)，但在培養9h的全細胞和細胞裂解物中Vop T呈明顯陽性(P/N值分別為6.67±2.33和8.53±4.15)，之后隨著培養時間的延長P/N值有所上升但不顯著(P>0.05)，12 h 培養物的全細胞和細胞裂解物的P/N值分別為7.54±3.12和9.06±4.38；而3～12 h培養物上清液作為包被抗原時，Vop T始終為陰性(P/N<2.1)。結果表明副溶血弧菌在生長過程中(3～12 h)，Vop T在生長后期表達并主要存在于細胞內或者膜表面，分泌到胞外的VopT及其微量，無法通過ELISA檢測出。因此，選擇培養時間9 h后的副溶血性弧菌細胞，經過超聲處理形成的裂解物后作為最佳檢測抗原。

2.6 抗血清交叉反應試驗結果 以不同來源的副溶血弧菌菌株以及溶藻弧菌、哈維氏弧菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌的細胞裂解物(106CFU·mL-1)作為包被抗原，檢測抗血清的特異性，結果(如表2所示)顯示只有副溶血性弧菌臨床株檢測結果呈陽性(P/N>2.1)，其余細菌均呈陰性(P/N<2.1)，表明副溶血性弧菌VopT蛋白具有良好的毒力菌株特異性。

注：A原液為108CFU·mL-1菌懸液;B原液為起始濃度為108CFU·mL-1菌懸液裂解產物；C原液為副溶血性弧菌12h培養物上清。OD值為3次測定的平均值。

Note:AStock solution is bacterial suspension of 108CFU·mL-1;BStock solution is pyrolysis products of 108CFU·mL-1bacteria suspension;CStock solution is culture supernatant ofVibrioparahaemolyticuscultured 12 h.

3 討 論

副溶血性弧菌耐熱性溶血素(TDH)及其編碼基因(tdh)是目前判斷該菌毒力的主要靶標。李巧蘋[8]等對tdh基因進行原核表達，并對表達產物進行免疫學特性研究，證實了重組菌表達的TDH與原始菌株產生的TDH抗原性一致，但是TDH在天然細菌中表達量極少，重組蛋白的抗血清卻不與胞外產物發生反應。另一方面流行病學調查也顯示了部分臨床菌株并不攜帶tdh基因[3,9]。本研究成功表達了副溶血弧菌VopT基因 (VPA1327)，通過免疫BALB/c小鼠制備了高效價的VopT抗血清(1∶25 600)，并且抗血清能夠與副溶血性弧菌的臨床菌株的12 h 培養物的菌體細胞和菌體裂解蛋白特異性反應，顯示了該蛋白在常規培養12 h后大量存在細胞膜上，這又可以為副溶血性弧菌毒力菌株菌體細胞的免疫檢測提供一個新的檢測靶標。

圖4 不同培養時間的副溶血性弧菌VopT ELISA檢測結果

Fig.4 Result of VopT detecting forVibrioparahaemolyticusat different culture time using ELISA.

注：a包被抗原為106CFU·mL-1的菌懸液裂解物；bOD值為3次測定的平均值；P、N分別表示陽性血清和對照血清測定值。

Notes:aCoating antigen is pyrolysis products of 106CFU·mL-1bacteria suspension;bOD value is average of 3 times; P, N signify testing value of positive serum and control serum respectively.

VPA1327是位于副溶血弧菌染色體Ⅱ上編碼一種推測胞外酶T的基因[4]，史東升等發現且該基因是具有副溶血弧菌特異性的基因片段[5]。VopT基因敲除能夠使副溶血弧菌毒力株的細胞毒性顯著減弱，顯示該基因與副溶血弧菌的致病性具有密切關系，但是目前對VopT的致病機理的研究較少。Kodama等[10]研究認為VPA1327的編碼產物(VopT)是一種具有ADP-核糖基轉移酶活性的效應蛋白，并且可以通過T3SS2分泌并轉移到宿主細胞內的。本研究結果顯示VopT重組蛋白的抗血清只與副溶血弧菌臨床株特異反應，而與副溶血弧菌環境株(非致病性菌株)溶藻弧菌、哈維氏弧菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌無交叉反應。盡管VPA1327編碼產物被推測為胞外酶，但本研究結果顯示副溶血性弧菌培養9 h后胞內VopT大量表達，但主要存在于胞內或者細胞膜表面，分泌到胞外的VopT無法通過ELISA檢測出，可能這種蛋白的分泌具有獨特的機制。盡管沙門氏菌、志賀氏菌都存在III型分泌系統[10]，但是細胞裂解物外均未檢測到VopT，表明VopT可能是副溶血弧菌毒力菌株特有的效應蛋白。VopT抗體的獲得為進一步研究VopT的分泌機制和致病機理提供了材料和方法。

[1]Alam MJ, Tomochika KI，Miyoshi SI, et al. Environmental investigation of potentially pathogenicVibrioparahaemolyticusin the Seto-Inland Sea, Japan[J]. FEMS Microbiol Lettr, 2002, 208(1): 83-87. DOI: 10.1111/j.1574-6968.2002.tb11064.x

[2]Nichibuchi M, Kaper JB. Thermostable direct hemolysin gene ofVibrioparahaemolyticus: a virulence gene acquired by a marine bacterium[J]. Infect and Immun, 1995, 63(6): 2093- 2099.

[3]Lee CY, Cheng MF, Yu MS, et al. Purification and characterization of a putative virulence factor, serine protease, fromVibrioparahaemolyticus[J]. FEMS Microbiol Lett, 2002, 209(1): 31- 37. DOI: 10.1111/j.1574-6968.2002.tb11105.x

[4]Kodama T, Hiyoshi H, Gotoh K, et al. Identification of two translocon proteins ofVibrioparahaemolyticustype III secretion system 2[J]. Infect Immun, 2008, 76(9): 4282-4289. DOI: 10.1128/IAI.01738-07

[5]Kodama T, Rokuda M, Park KS, et al. Identification and characterization ofVopT, a novel ADP-ribosyltransferase effector protein secretedviatheVibrioparahaemolyticustype Ⅲ secretion system 2[J]. Cell Microbiol, 2007, 9(11): 2598-2609. DOI:10.1111/j.1462-5822.2007.00980.x

[6]Shi DS. Identification and evaluation of new molecular targets for detection ofVibrioparahaemolyticus[D]. Shanghai: Shanghai Jiaotong University, 2008. (in Chinese) 史東升. 副溶血弧菌分子檢測靶點的發掘與評價[D]. 上海：上海交通大學, 2008.

[7]Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al. Short protocols in molecular biology[M]. Beijing: Science Press, 1999. (in Chinese) F 奧斯伯, R 布倫特, RE 金斯頓, 等. 精編分子生物學實驗指南[M]. 北京：科學出版社, 1999.

[8]Li QP. Cloning, expressing and indentifying of thermostable direct hemolysin fromVibrioparahaemolyticus[D]. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2004. (in Chinese) 李巧蘋. 副溶血弧菌耐熱直接溶血素基因的克隆表達與鑒定[D]. 福建農林大學, 2004.

[9]Shirai H, Ito H, Hirayama T, et al. Molecular epidemiologic evidence for association of thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin ofVibrioparahaemolyticuswith gastroenteritis[J]. Infect Immun, 1990, 58(11): 3568-3573.

[10]Makino KK, Oshima K, Kurokawa K, et al. Genome sequence ofVibrioparahaemolyticus: a pathogenic mechanism distinct from that ofV.cholerae[J]. Lancet, 2003, 361(9359): 743-749. DOI: 10.1016/S0140-6736(03)12659-1

Expression ofVibrioparahaemolyticusVop T protein and the specificity of its antibody against virulent strain

YANG Zhen-quan1,3,RAO Sheng-qi1,GAO Lu1,XUE Feng2,LI Ping1,FANG Wei-ming1,JIAO Xin-an3

(1.College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China;2.Animal, Plant and Food Inspection Center of Jiangsu Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing 210001, China;3.Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis, Yangzhou 225009, China)

The aim of this study is to determine group specificity ofVibrioparahaemolyticusVop T protein and provide bases for establishing a rapid detection method and exploring the mechanism of VopT action. The gene VPA1327 which encode Vop T protein was amplified from pathogenicV.parahaemolyticusstrain WX06152 (serotype O3∶K6) by PCR using a pair of synthesized primers. The resulted amplicon in the size of 711 bp was subcloned into vector pET-30a (+), and the resulted recombinant expression plasmid pET-VPA1327/DE3 was transformed into theE.coliBL21 (DE3). After IPTG induction, a recombinant protein was identified using MALDI-TOF-MS/MS spectrum and purified by His affinity column. The antiserum against the VopT was successfully obtained by immunization of the purified recombinant protein to BALB/c mice, and an indirect ELISA for rapid detecting VopT protein of pathogenicV.parahaemolyticuswas developed using the antiserum as the detective antibody. The result showed that the obtained fussion protein, in the size of 33 kDa, showed the same peptide fingerprint with theV.parahaemolyticusVopT protein. The developed indirect ELISA method can specifically detect bacterial cell and its lysate ofV.parahaemolyticuswith the lowest detective limit of 105CFU mL-1. The result of crossing test showed that the VopT antiserum had good specificity against virulent strains ofVibrioparahaemolyticus, and no cross-reaction observed with environmental strains ofV.parahaemolyticusand selected bacterial strains belonging to other species. The data present in this study provides a new way to understand VopT action mechanism of pathogenicV.parahaemolyticusstrains.

Vibrioparahaemolyticus; VopT protein; prokaryotic expression; polyclonal antibody; specificity

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.05.011

1.揚州大學食品科學與工程學院，揚州 225127; 2.江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，南京 210001； 3.揚州大學江蘇省人獸共患病重點實驗室， 揚州 225009

R378

A

1002-2694(2015)05-0441-06

2014-10-09；

2015-02-16

江蘇省科技支撐計劃項目(No. BE2013733)、蘇北科技發展計劃項目(No. BC2013438)聯合資助